京枣试管苗染色体稳定性的策略分析

植物组织培养技术已广泛应用于珍贵种质资源的离体保存、优良体细胞无性系变异材料的创建以及物种库的建立和保存，因而研究组培试管苗能否稳定遗传具有很大的应用价值。目前，国内外关于山葡萄[1]、芥蓝[2]、百合等[3～6]品种组培苗遗传稳定性的报道有许多，但关于枣树组培苗遗传稳定性的研究较少[7～10]。本试验旨在通过探讨京枣组培苗的遗传稳定性，为枣树组培苗的快繁、生产和推广提供理论依据与指导。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料与试剂 　　供试材料为京枣（Zizyphus jujuba Mill. Jingzao）试管苗，由陕西省延安大学红枣繁育工程重点实验室提供，取继代培养20代后经生根培养基生根的京枣试管苗根尖用于染色体观察。 　　用于染色体制片的主要试剂有饱和对二氯苯溶液、改良苯酚品红染液、0.075 mol/L氯化钾溶液。 　　1.2培养基和培养条件 　　试管枣苗生根培养基（S15）：1/2 MS+1.0 mg/L IBA +0.02 mg/L NAA +20%蔗糖+0.55%琼脂。 　　培养条件：温度为24～27℃，相对湿度为60%～65%，光照强度为1 500～2 000 lx。 　　1.3材料准备与取样 　　根据试管苗的长度，将继代培养的京枣试管苗剪成2～4 cm的茎段，转接到S15生根培养基，接种后第3天统计生根的试管苗数，以后每隔5天统计生根数。 论文网 　　取样：取刚长出1.5～2.0 cm长的根，此时根分生能力最旺盛，最适合于染色体观察。取样时间：上午9时。 　　1.4材料处理 　　（1）预处理：将所取材料浸入饱和对二氯苯溶液，振荡培养箱常温振荡4 h。 　　（2）固定：预处理后，用蒸馏水将材料清洗3次，每次3～5 min，再用现配的Carnoys固定液（无水酒精∶冰醋酸=3∶1）常温下固定12 h。 　　（3）前低渗：固定后的材料用蒸馏水清洗3次，每次3～5 min，然后用滤纸将材料上的水分吸干，放入0.075 mol/L KCl溶液中30 min，15 min换液一次。 　　（4）解离：将材料置于1 mol/L HCl中60℃恒温水浴加热，根尖解离时间不宜过长，一般为10 min，解离充分的标志是组织间有大量气泡，解离后的材料用镊子夹出迅速放入1 mol/L冷盐酸中浸泡30 s。 　　（5）后低渗：经冷盐酸浸泡后，蒸馏水清洗3次，每次3～5 min，放入0.075 mol/L KCl溶液中60 min，30 min换一次溶液。 　　（6）染色：用改良苯酚品红染液染色24 h。 　　（7）压片：选取材料分生最旺盛的部分（一般为未展开叶片的叶原基、茎尖的分生组织），用解剖针取肉眼刚好能看清的一小块组织，放在洁净的载玻片上，盖上盖玻片（中间不能有气泡）。 作文 /zuowen/ 　　（8）脱水：将染色压制好的制片，倒放在盛有45%醋酸+95%酒精（V∶V=1∶1）的培养皿中，使载玻片稍倾斜（一边垫上一玻棒），经5～10 min，可见盖玻片从载玻片上脱离，用吸水纸吸去载玻片和盖玻片边上多余的酸液，再依次经过以下浓度梯度的酒精：20%、30%、50%、70%、85%、95%、100%，每个浓度停留30 min。 　　（9）透明：经过以下步骤：1/3二甲苯﹢2/3纯酒精 1/2二甲苯﹢1/2纯酒精2/3二甲苯+1/3纯酒精纯二甲苯，逐步进行，每步3 min，使材料既除去酒精，又不收缩变形。 　　（10）封藏：将玻片从二甲苯中取出，在标本上滴光学树胶（树胶的量以盖上盖玻片后刚好铺满为合适），然后盖上一同处理的盖玻片（中间没有气泡）。将封好的玻片标本在恒温培养箱中40℃烘烤至干燥，贴上标签，即可永久保存。 　　（11）镜检：4010倍光学显微镜观察约60个比较清晰的分裂相细胞，鉴定其中的染色体数目，进行OLYMPUS显微照相。 　　2结果与分析 　　对60个根尖细胞进行染色体计数分析，从表1可以看出，京枣根尖染色体数目2n=24的占85%，百分数检验差异极显著，说明京枣继代培养20代的组培苗染色体数目未发生变化，即表现稳定遗传。染色体图见图1。

3讨论 　　3.1染色体制片方法的探讨 　　3.1.1解离时间和温度的把握 枣树细胞的细胞壁比较厚，解离时间不能太短，时间太短，会使解离不彻底，染色效果不好，甚至染不上色；但也不能太长，否则酸会水解染色体中的蛋白质，使染色体受损，难以得出正确的实验结果。因此，在解离时，要注意随时观察组织的解离状况，有大量气泡即说明解离充分，一般为10 min。解离温度要控制在60℃，温度过高会使酸解离速度加快，导致解离的进程不能被很好的控制。因此，本试验采用两支温度计，一支测解离直管内的实际温度，一支测定管外水温，从而准确控制解离温度。 　　3.1.2低渗时间酸浓度的高低对染色体的皱缩程度有一定影响，过高会使染色体高度皱缩，从而影响染色体观察。低渗可以通过离子互换降低组织间的酸浓度，使染色体膨胀，在压片后保持清晰的形态，以利于观察，如果低渗时间过短，会使染色体皱缩，难以观察。根据本试验的结果，枣树染色体的低渗时间以1 h 为宜。　3.2结果探讨本试验试管枣苗染色体出现24、48、23、22、21、19等多种数目。有关染色体变异的原因，多数学者认为与核内有丝分裂、核融合、核内复制、多极有丝分裂及染色体断裂等现象有关，是培养基中多种激素作用引起组培材料细胞分裂异常所致[11]。类似的组培过程中染色体数目变异的情况还发生在金丝小枣、黑麦草、甜瓜、四合木、百合等植物中[10]。也有人认为染色体变异与材料来源、成苗途径及培养时间等因素有关[6]。由于本试验对所有材料都是平行处理，推测出现的少数染色体数目变化除细胞分裂异常原因外，还可能是在制片过程中没有将细胞充分压开，导致有的染色体粘在一起或相互重叠而看不清楚，也有可能是在压片时用力过猛使染色体溢出细胞外。 开题报告 /html/lunwenzhidao/kaitibaogao/ 　　本课题通过染色体制片和显微镜观察相结合的方法对京枣试管苗的核型进行了初步研究，试验结果证明该品种试管苗经继代培养基培养后仍能够稳定遗传，这为枣树组培快繁的应用、优良品种选育以及组织培养育种等提供一定的理论参考，同时也为进一步的染色体研究奠定了基础。 　　参考文献： 　　[1]宋润刚， 路文鹏， 王军， 等. 山葡萄品种脱毒苗遗传稳定性及其生产性能的研究[J]. 园艺学报， 1999， 25（3）：131—135. 　　[2]庄东江， 黄文华， 郑汉藩， 等. 芥蓝组培苗遗传稳定性的研究[J]. 汕头大学学报（自然科学版）， 1999， 14（1）：54—57. 　　[3]谢丽琼， 王咏星， 刘晓 作文 /zuowen/。