白背三七多糖的提取纯化及含量测定

作者：姜曼花 邱细敏 刘胜姿 彭胜 黎强。

【摘要】 　　目的确定白背三七多糖的最佳提取方案，对其多糖进行分离纯化和含量测定。方法建立正交实验，对其提取方案进行优化；通过Sevage法脱蛋白、乙醇沉淀以及DEAE－52柱层析进行分离纯化；蒽酮—硫酸法测定其总多糖含量。结果温度90℃，固料比1:9，提取时间2 h；提取次数2次，所得多糖的含量最高。蒽酮—硫酸法测得粗多糖含量为1.49%；DEAE－52柱层析分离纯化分别得到组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ。结论水提白背三七多糖工艺简便，投资少，有利实现工业化大生产。

【关键词】 白背三七 多糖 蒽酮—硫酸法。

Abstract：ObjectiveTo fix an optical extractive method and to make separation，purification and content determination of polysaccharide in Gynuradivaricata(L.)DC. MethodsOrthogonal experiment was introduced to study the optimum extraction process of Gynuradivaricata(L.)DC. polysaccharide (GDPS）. The polysaccharide was purified using sevage deprotein and DEAE—52 column chromatography.To make content determination with the method of anthranone—sulphuric acid.ResultsThe optimal extracting conditions were:extracting temperature 90℃， the ratio of solid and liquid 1:9； extracting time 2h and extracting twice;the content percentage of rude polysaccharide was 1.49%. GDPSⅠ、Ⅱ、Ⅲ were obtained through DEAE—52 column chromatography.ConclusionIt‘s simple, costless to extract polysaccharide with water—boiling method.

Key words：Gynura divaricata(L.)DC.; Polysaccharide; Extraction and purification; Content determination 　　白背三七Gynuradivaricata(L.)DC.为菊科三七草属植物，又名白(百)子菜，分布于台湾至华南、西南一带，喜生于潮湿的阴地上［1］，根、茎、叶均可入药，其根及根茎味甘，性凉，有清热、凉血、散淤消肿之功效，用于咳嗽痰喘、肺痈、崩漏、烫伤、跌打损伤、刀伤出血等症；而茎叶味咸，微辛，性凉，有消热，舒筋及止血，祛淤的作用，用于镇咳、风湿性关节痛、骨折、创伤出血、痈肿疮疥等症。在民间则作为一种保健野菜，由于其能促进人体新陈代谢，增强体力，滋补强身，延年益寿而备受青睐。湖南岳阳地区众多糖尿病患者长期食用，有效控制了血糖升高，因不知植物名而被患者称为“救命草”。网上则称其为“神奇的植物”，也有称其为“明日叶”或“明日草”等。药理学研究表明，多糖(polysaccharide) 是构成生命的四大基本物质之一，多糖在增强免疫力［2］、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面发挥着生物活性作用。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。关于白背三七栽培技术文献报道较多［3］，化学活性成分仅见该植物吡咯啶生物碱［4］、黄酮类成分［5，6］及脂肪酸成分分析［7，8］的报道，尚未见其多糖的研究报道。本文报道白背三七多糖的提取纯化及含量测定。

1 器材。

1.1 仪器UV—2501 PC紫外分光光度计，DEAE—52层析柱　　1.2 药材与试剂无水乙醇、浓硫酸、蒽酮、氯仿、正丁醇（均为分析纯）、葡萄糖标准品（国药集团化学试剂有限公司）、白背三七药材（岳阳市场上购买）。

2 方法。

2.1 白背三七多糖的提取。

2.1.1 提取温度的确定 取已干燥的药材15 g，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材按1：7的比例，以水为溶剂，分别在不同的温度下提取2次，提取2 h/次。

2.1.2 提取时间的确定取已干燥的药材15 g，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材按1：7的比例，以水为溶剂，90 ℃下，不同持续提取时间下提取2次。

2.1.3 料液比的确定取已干燥的药材15 g ，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材90 ℃下，按不同的料液比提取2次，提取2 h/次。　　2.1. 4 提取次数的确定取已干燥的药材15 g，按药材：石油醚＝1:3进行脱脂，脱脂后的药材90 ℃下，提取2 h/次，提取不同次数。

2.1.5 正交实验通过单因素实验确定最佳因素水平，为了消除各因素间的相互影响，根据这些确定的因素，确定正交因素的各个水平。根据各实验因素水平即提取时间、提取温度、固液比、提取次数4因素3个水平按表1进行正交设计提取。见表1。

表1 因素与水平（略）。

2.2 脱蛋白本实验采用sevage法脱蛋白，粗多糖加适量水溶解，加入1/5体积的sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），强烈振摇30 min。静置分层，除去交界处变性蛋白，重复处理3次。在200~400 nm处扫描未见蛋白质吸收峰。

2.3 粗多糖的分离纯化。

2.3.1 粗多糖初步分离纯化 收集提取液，于离心机3000 r/min—1离心10 min，取上清液。加入3倍量95%的乙醇，冰箱冷藏24 h，次日于离心机3000 r/min—1离心20 min，取沉淀，用丙酮，乙醚各洗涤3次，冷冻干燥，得灰白色粉末状的粗多糖。

2.3.2 DEAE—52柱层析分离纯化 　　DEAE—52预处理：取DEAE—52适量，用蒸馏水浸泡，分别用0.5 mol·L—1的NaOH及0.5 mol·L—1 HCl处理30 min，抽干用蒸馏水洗至中性后， 用pH 6.0磷酸缓冲液处理后脱气装柱。 　　DEAE52柱层析：采用DEAE52柱层析(30 cm×2.5 cm)进行色谱分离，上样前用双蒸水平衡2 h，取0.05 g·ml—1白背三七多糖样品上柱，待其渗入DEAE52后，用双蒸水以1 ml·min—1流速洗脱，10 ml管收集。隔管用蒽酮－硫酸法在626 nm处测定吸光度，直至无洗脱峰洗出为止。继而用0.05%，0.1%，0.3%，0.5 KCl ，以1 ml·min—1流速梯度洗脱，10ml管分部收集。蒽酮—硫酸法626 nm波长处检测，至洗脱液吸光度为0时更换梯度，根据所得吸光度值作多糖洗脱曲线。

2.4 粗多糖含量测定［9］。

2.4.1 蒽酮试剂的配制［10］称取1 g蒽酮溶解于500 ml 80%的硫酸中，置入棕色瓶中，暗处静置，临用临配。

2.4.2 波长选择称取105℃干燥恒重的葡萄糖适量，加水溶解使成240.0 mg/L作对照品溶液。取对照品溶液0，0.5 ml置具塞试管内，分别加水1.0，0.5 ml，加入新鲜配制的蒽酮试剂(0.2%蒽酮的80%硫酸溶液)8.0ml沸水浴加热10 min，迅速置冰水浴冷却10 min后，以首管为空白，在500~700 nm处扫描，确定最大吸收波长为626 nm。

2.4.3 标准曲线的绘制 称取干燥恒重的葡萄糖适量，加水溶解使成240.0 mg/L，精密量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 ml置具塞试管内，加水至1.0 ml，分别编号为0，1，2，3，4，5，6再分别加入新鲜配制的蒽酮试剂(0.2%蒽酮的80%硫酸溶液)8.0 ml沸水浴加热10 min，迅速置冰水浴冷却10 min后，以首管为空白，在626 nm处测定吸收度，以浓度对吸收度作工作曲线。