hTERTmRNA在胃癌中表达及其与预后的效果观察
胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，就诊患者中约90%为进展期胃癌，极易发生侵袭、转移，预后差，严重威胁着人们的身体健康。
探讨胃癌侵袭转移的分子机制，寻找与其相关的生物学标志物是当今肿瘤学研究的热点之一[1]。
端粒酶是一种与细胞永生化和肿瘤形成相关的核糖核蛋白酶，它能够以细胞内部的一段RNA为模板合成端粒末端重复序列而延长端粒，从而使细胞永生化。
人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是人类端粒酶的催化亚单位，是端粒酶活性高低的限速酶。
hTERT的表达与端粒酶活性呈正相关，可以反映端粒酶活性的高低[2—4]。
研究已证实，端粒、hTERT与正常细胞生长调控及恶性肿瘤之间密切相关。
目前有关hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌发生的始动阶段，hTERT高表达可促进胃癌的发生[5]。
本研究选取52例胃癌患者为研究对象，应用RT—PCR方法检测hTERT mRNA在同一患者的正常胃黏膜、胃癌原发灶及转移灶（即转移淋巴结）中的表达，通过随访，系统研究hTERT mRNA在胃癌中的表达情况及其与胃癌恶性生物学行为和预后的关系。
1 资料与方法 1.1 一般资料 以2001年9月～2002年9月中国医科大学附属第一医院肿瘤外科52例胃癌患者为研究对象，收集患者新鲜大体组织标本。
在手术切除胃癌大体标本30 min内，切取胃原发癌灶和正常胃黏膜及转移淋巴结，放入消毒灭菌的EP管中，于液氮中速冻0.5 h后转入—70℃冰箱中冻存等待检测，以上标本均经病理证实，并保留其石蜡标本。
对52例患者进行随访，主要通过门诊复查、电话信函问询、派出所户籍查询等，随访终点为2010年9月，随访率为100%，随访时间为8～106个月，平均48.5个月。
1.2 RT—PCR检测hTERT mRNA的表达 严格按照TRIzol试剂盒说明书进行操作，提取所有新鲜大体标本总RNA，测定其OD260、OD280值，对总RNA进行定量；应用RNA琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
取高质量总RNA 1 g进行逆转录合成第一链cDNA，然后取3 l cDNA水溶液进行PCR扩增，具体条件：94℃ 5 min，94℃ 40 s、58℃ 45 s、72℃ 60 s（30个循环），72℃ 7 min。
hTERT基因引物序列为：5—CGTCCAGACTCCGCTTCAT—3，5—TGCTTCTTGTGGTCCTCAGA—3，产物为340 bp；内参基因GAPDH引物序列为：5—AGGGGTCTACATGGCAACTG—3，5—CGACCACTTTGTCAAGCTCA—3，产物为227 bp。
扩增产物经梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色检测，详细步骤参见文献[6]。
用Fluorchem V2.0 Stand Alone电泳凝胶扫描仪对电泳凝胶进行扫描，应用其自带的分析软件进行灰度（A）测定，电泳中有扩增产物条带者为阳性，无扩增产物条带者为阴性；计算hTERT mRNA表达指数（ImRNA），I=A（hTERT）/A（GAPDH），ImRNA与其在组织中的表达量呈正比。
1.3 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据，应用配对均数t检验比较hTERT mRNA在胃原发癌灶、正常胃黏膜、淋巴结转移癌中表达的差异；应用单因素方差分析评估其在胃原发癌中表达与胃癌生物学行为的相关性；应用Kaplan Meier分析绘制生存曲线，采用Log Rank检验评估其在胃原发癌灶中表达与预后的关系，以P0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 hTERT mRNA在胃原发癌灶、正常胃黏膜和淋巴结转移癌中表达情况的比较 与正常胃黏膜（0.0220.093）相比，hTERT mRNA在胃原发癌灶中（0.5150.352）表达水平（t=9.969，P0.01）和淋巴结转移癌中（0.7290.578）表达水平（t=7.814，P0.01）明显增高，且在淋巴结转移癌中增高更明显，而其在胃原发癌灶和淋巴结转移癌中表达水平差异无统计学意义（t=1.602，P=0.117）。
在胃正常黏膜中多数表达阴性或仅有微弱条带。
内参基因GAPDH在不同标本中表达水平基本一致（图1）。
2.2 hTERT mRNA在胃原发癌灶中表达与胃癌生物学行为的相关性 经过单因素方差分析发现，胃原发癌灶中hTERT mRNA表达水平在浸润型癌、肿瘤浸透浆膜面、浆膜侵犯面积20 cm2、淋巴结分期（7th TNM分期）晚者（N3）者中表达水平明显增高，而在限局型癌、肿瘤未浸透浆膜面、浆膜侵犯面积20 cm2、淋巴结分期早者（N1～2）中表达水平相对较低。
其表达水平与其他临床病理因素无明显相关性（如肿瘤大小、部位、分化程度、生长方式、有无脉管癌栓，患者性别、年龄等）（表1）。
2.3 hTERT基因 mRNA表达与胃癌患者预后的相关性 将hTERT mRNA在胃原发癌灶中表达水平以平均值为界分为高低两组（其表达指数平均值为0.515），高于平均值者为高表达，低于平均值者为低表达，两组各26例。
经Log Rank检验发现，hTERT mRNA低表达组比高表达组预后明显好（2=14.20，P=0.0002）；hTERT mRNA低表达组患者5年生存率为60.04%，高表达组患者为17.41%，两组差异有统计学意义（P0.05）。
在本组患者中，15例腹膜复发转移者中有10例为hTERT mRNA高表达，提示hTERT mRNA高表达可能与胃癌腹膜复发转移关系密切。
3 讨论 随着分子生物学的发展，端粒、端粒酶与肿瘤关系的研究越来越引起人们的重视。
研究表明，hTERT在胃黏膜肠化生、异型增生及胃癌中表达均明显高于正常胃黏膜，提示hTERT表达增高是胃癌发生的极早期事件，在胃癌发生的始动阶段起重要作用[5，7—9]。
在检测胃癌患者外周血中hTERT mRNA表达的研究中发现，其表达率明显高于胃良性病变者和健康人，表明其可以作为胃癌早诊和预测微转移的分子生物学指标之一，这在国内外研究中均得到证实[10—13]。
如上所述，目前有关hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌发生的始动阶段，有关hTERT mRNA与胃癌侵袭、转移、预后关系的报道相对较少，且意见不一。
本研究发现hTERT基因mRNA在胃原发癌灶和淋巴结转移癌中表达增高，而癌旁正常胃黏膜中表达极弱或不表达，而且在转移灶（淋巴结转移癌）中表达增高更为明显。
深入研究其与胃癌临床病理因素之间的关系时发现hTERT mRNA在胃原发癌灶中表达水平与胃癌浸润深度、外科分型、浆膜侵犯面积、淋巴结分期（即转移程度）密切相关。
在肿瘤浸透胃浆膜面、浸润型癌、浆膜侵犯面积大及淋巴结转移数量多（7枚以上）的胃癌患者中，hTERT mRNA表达水平显著升高。
有学者研究发现腹腔冲洗液中端粒酶活性与胃癌分化程度、浸润深度、浆膜受侵面积和腹膜转移密切相关[15]。
结合文献及本研究结果表明，hTERT具有促进胃癌侵袭转移的能力，与胃癌的恶性生物学行为呈正相关。
既然hTERT mRNA与胃癌的恶性生物学行为呈正相关，可以推论其可能影响患者的预后。
本研究进行生存分析时发现，hTERT mRNA高表达组较低表达组明显预后不良，5年生存率分别为17.41%和60.04%，与文献报道基本一致[16—17]。
进一步分析发现15例腹膜复发转移者中有10例为hTERT mRNA高表达。
本研究发现hTERT表达水平与TNM中N分期呈正相关，提示hTERT基因与胃癌转移复发密切相关，有可能成为监测胃癌转移复发新的分子标志物和潜在的分子治疗靶标，但是其详细机制有待进一步研究探讨。
综上所述，胃癌组织中hTERT mRNA的表达与胃癌的浸润、转移及患者的生存期密切相关，检测hTERT mRNA在胃癌组织中的表达情况，有助于判断胃癌患者的转移情况和预后，可更好地指导胃癌治疗。
[参考文献] .Lancet Oncol，2008，9（3）：279—287. [2] Kyo S，Kanaya T，Takakura M，et al.Human telomerase reverse transcriptase as a critical determinant of telomerase activity in normal and malignant endometrial tissues[J].Int J Cancer，1999，80（1）：60—63. .Anal Biochem，2003，315（1）：1—21. [4] Kirkpatrick KL，Mokbel K.The significance of human telomerase reverse transcriptase （hTERT） in cancer[J].Eur J Surg Oncol，2001，27（8）：754—760. .Arch Med Res，2010，41（1）：1—6. [6] 黄宝俊，赵雨杰，徐惠绵，等.hRad17 mRNA 在胃癌中表达的意义[J].中华肿瘤杂志，2003，25（2）：160—162. [7] 伍冬梅，李春鸣，张赁.胃癌组织中hTERT基因表达及意义[J].山东医药，2011，51（7）：65—66.