早孕外周血及蜕膜中NK细胞表型及T淋巴细胞亚群的变化

作者：肖敏, 凌斌*, 陈峥峥, 周颖, 程志祥, 高宗侠, 冯定庆。

【摘要】 　　目的: 检测孕妇外周血及蜕膜中T淋巴细胞亚群和NK细胞表型, 探讨它们与母胎界面免疫耐受的关系。方法: 收集20例早孕同一患者的蜕膜组织及外周血, 密度梯度离心法分离出淋巴细胞, 流式细胞术（FCM）检测两组中NK细胞、 T细胞含量及其表面分子CD16、 NKG2A、 NKG2D表达水平。结果: 蜕膜自然杀伤（dNK）细胞占蜕膜淋巴细胞(57.15±4.0)%, 外周血自然杀伤（pNK）细胞占外周血淋巴细胞(11.46±1.58)%; dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞, 二者分别(10.3±3.9)%与(95.6±2.6)%(P0.05); dNK细胞表面NKG2A的表达明显高于pNK细胞, 二者分别为(87.10±4.5) %与(27.5±4.2)% (P0.01), dNK细胞NKG2D的表达水平与外周血NK细胞相近, 分别为(88.70±4.1)%与(93.10±3.6)% (P0.05); 蜕膜中的CD4+T淋巴细胞的表达低于外周血中CD4+T淋巴细胞, 二者分别为（13.70±1.0）%与(15.85±2.4)% (P0.05), 蜕膜中CD8+T淋巴细胞表达明显低于外周血中CD8+T淋巴细胞, 二者分别为（15.23±1.5）%与（18.85±1.73）%(P0.01)。结论: 妊娠期蜕膜中的NK细胞及T淋巴细胞可能是同维持母胎界面的免疫耐受的重要原因。

【关键词】 蜕膜 NK细胞 T细胞。

在人类妊娠过程中, 胎儿是同种异基因产物, 携带父系的异源MHCI类分子, 却能抵御母体免疫细胞的攻击, 这与经典的移植免疫理论相矛盾[1]。虽然已经提出几个主要因素去解释正常妊娠的免疫生物学和妊娠相关的合并症, 但还是很局限。近年来研究发现, 子宫蜕膜组织中含有的免疫细胞包括大颗粒淋巴细胞, NK细胞, 蜕膜巨噬细胞, T淋巴细胞以及少许B淋巴细胞, 其中NK细胞含量最丰富, 占全部蜕膜免疫细胞的70%～80%[2], 其比率随着妊娠的发展而改变。随着胚胎的植入, 蜕膜自然杀伤细胞（decidual natural killer cells, dNK）的数量明显上升, 它们聚集在胎盘部位的蜕膜处与侵入的滋养层细胞密切接触并分泌多种细胞因子调节母胎界面间的免疫平衡。dNK细胞通过影响滋养层细胞的侵袭和分化来控制胎盘的形成。基于dNK细胞的功能和在胚胎植入早期的大量增殖并广泛分布于滋养层细胞侵入的底蜕膜, 人们推测dNK细胞在维持母胎界面免疫平衡中起了重要作用。最近报道认为NK的活性是由淋巴因子调节的, 而激活的T细胞可以释放淋巴因子调节NK的细胞毒活性。本实验中通过比较母胎界面处dNK, T与外周血NK, T表型及含量的变化, 进一步揭示母胎界面免疫耐受的调节机制。

1 材料和方法。

1.1 材料 在我院计划生育门诊2006—05/2007—0120例要求人工流产、 孕6～8周的正常妊娠妇女, 平均年龄（25.2±5.2）岁, 既往月经规则, 无病理妊娠史, 此次妊娠期间无阴道异常出血, B超检查提示胚胎发育正常, 有胚囊、 胚芽及心血管搏动。人淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海华精生物有限公司; 不同荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体（mAb）(CD3FITC、 CD3CY、 CD4FITC、 CD8PE、 CD56CY、 CD56PE、 CD16FITC)购自BD Pharmigen公司; 澡红蛋白标记的鼠抗人mAb(NKG2APE、 NKG2DPE)购自RD公司; FACS检测仪为BD FACECalibur公司产品。

1.2 方法。

1.2.1 标本采集 经患者同意, 人工流产术之前接上无菌负压吸引瓶, 取患者蜕膜组织, 置于盛有冰预冷的1×PBS离心管中。迅速运回实验室, 在超净台内将新鲜蜕膜组织用 PBS 洗2、 3次, 除去血凝块, 小心去除蜕膜组织中绒毛组织。

1.2.2 蜕膜和外周血单个核细胞的分离 将洗净的蜕膜组织用眼科小剪刀剪切成1 mm左右的组织块, 置于120目铜网中, 4℃ PBS冲洗, 用1次性注射器橡皮头研磨, 将滤液再通过100目铜网, 离心浓缩后溶于RPMI1640培养液, 以1∶1体积比平铺于Ficoll淋巴细胞分离液上, 2000 r/min离心25 min, 缓慢增速, 无制动停转, 取出中间层淋巴细胞层, PBS洗涤2次, 20 g/L台酚蓝排除法测活细胞90%, 调细胞密度为1×109/L。

1.2.3 外周血单个核细胞的分离 外周血加入等体积的PBS 稀释, 然后以1∶1比例沿管壁缓慢加在淋巴细胞分离液液面上, 2000 r/min离心20 min, 吸取淋巴细胞层。用PBS洗涤2次, 调整细胞密度1×109/L, 20 g/L台酚蓝排除法测活细胞90%。

1.2.4 FCM检测细胞表面分子 取单个核细胞悬液100 μL(约1×106细胞)分装至1.5 mL EP管中, 每管分别加入10 μL小鼠血清, 以阻断Fc受体(空白对照管除外), 4℃避光放置30 min加入相应抗体各2 μL, 标记CD3、 CD56、 CD16、 NKG2A、 NKG2D、 CD4、 CD8避光放置30 min, 1×PBS洗涤2次后, 加入200 μL PBS(PBS+1 g/L叠氮钠)重悬细胞, 上机检测, 用WinMDI29软件程序分析数据。

1.2.5 统计学处理 SPSS13.0统计分析软件分析数据, 结果以x±s表示, 数据进行t检验。

2 结果。

2.1 正常早孕dNK细胞与pNK细胞含量的比较 与外周血相比, 蜕膜中的dNK细胞占蜕膜淋巴细胞的(57.15±4.0)%, pNK细胞占外周血淋巴细胞(11.46±1.58)% (P0.05)。

2.2 正常早孕dNK细胞与pNK细胞表型含量的比较 dNK细胞与pNK细胞表型差异明显, dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞, 二者分别为（10.3±3.9)%与(95.6±2.6)%(P0.05); NKG2A的表达明显高于pNK细胞, 二者分别为(87.10±4.5)%与(27.5±4.2)% (P0.01), dNK细胞NKG2D的表达水平与pNK细胞相近, 分别为(88.70±4.1)%与(93.10±3.6)%, 有统计学意义(P0.05, 表1)。