Avermectin B1a组分高产菌株的诱变育种

; 作者：任超 马王向坡 李宝库 路新利。

【关键词】; Avermectin,B1a组分；,诱变；,效价；,高产菌株。

摘要： 目的 了解avermectin产生菌S.avermitilis的生长特性，提高产生菌B1a组分的产量。方法 采用紫外线、诱变剂亚硝基胍并结合甲硫氨酸诱变等手段对出发菌株S.avermitilis N56进行诱变处理，初筛、复筛。结果 筛选获得总效价达到45258μg/ml的高产除虫链霉菌突变株A3，B1a比例提高到560%。结论 采用紫外线及亚硝基胍诱变方法，结合甲硫氨酸诱变筛选，与出发菌株相比可以获得avermectin总效价及B1a组分显著提高的菌株。

关键词： Avermectin B1a组分； 诱变； 效价； 高产菌株。

; ABSTRACT Objective To study the characteristics of avermectin producing strains and improve avermectin B1ayield of Streptomyces avermitilis. Method UV and NTG were used as mutagens to treat the original strain N56 as well as methionine as inducer. Results The highyield avermectin strain A3 with avermectin total titer up to 45258 μg/ml was obtained, the ratio of avermectin B1awas increased to 560%. Conclusion It is an effective method of screening highyield avermectin B1athrough mutation by UV and NTG and induction with methionine.

KEY WORDS Avermectin B1a; Mutagenesis; Titer; Highavermectinproducing strain。

; Avermectin的产生菌是除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，该菌株是1975年日本北里研究所(Kitasato Institute)从日本静岗县地区的一个土壤样品中分离得到的。研究初期已发现该菌株的发酵液具有很高的驱肠道寄生虫活性，该菌株后被送到美国Merck公司作进一步研究。1976年，美国Merck公司的科研人员分离了这组具有驱虫活性的物质，并将其命名为avermectins［1］。Avermectins是一类结构相似的十六元大环内酯类抗生素，共有8个组分，分别命名为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b。其中A1a、A2a、B1a和B2a为4个大量组分，含量在80%以上；A1b、A2b、B1b和B2b为4个小量组分，含量在20%以下，结构见图1。B1的杀虫活性最高，毒性最小。近年，众多科研工作者通过诱变等手段改造菌种的遗传特性，提高avermectin有效组分B1比例，大村智等在这方面做了很多贡献［2］。Avermectin B1a(大于80%)和B1b(小于20%)混合物阿巴菌素(abamectin)已用于畜牧抗虫和农业上的杀螨及选择性的杀虫剂。Avermectins R1 XY R2A1a CH3 CH=CH C2H5A1b CH3 CH=CH CH3A2a CH3 CH2—CH(OH) C2H5A2b CH3 CH2—CH(OH) CH3B1a H CH=CH C2H5B1b H CH=CH CH3B2a H CH2—CH(OH) C2H5B2b H CH2—CH(OH) CH3图1 Avermectins结构图。

; 1 材料和仪器。

; 1.1 菌种除虫链霉菌S.avermitilis N56由河北大学微生物研究所提供；突变株A3由甲硫氨酸平板筛选获得。

; 1.2 试剂生理盐水，亚硝基胍(NTG)，磷酸盐缓冲液(pH60)，甲硫氨酸(Met)，丙酮(分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)，无水甲醇(色谱纯及分析纯)，GF254硅胶粉，三氯甲烷(分析纯)，二氯甲烷(分析纯)。

; 1.3 培养基斜面和分离培养基(g/L) 可溶性淀粉10，(NH4)2SO4 25，NaCl 06，MgSO4・7H2O 12，K2HPO4・3H2O 30，CaCO3 30，琼脂粉20，pH72～74，用蒸馏水配制。种子培养基(g/L) 玉米淀粉25，花生饼粉10，黄豆饼粉80，酵母粉50，酵母膏50，玉米浆40，CoCl2・6H2O 0003，淀粉酶00025，pH70～72，用自来水配制。发酵培养基(g/L) 玉米淀粉70，花生饼粉10，黄豆饼粉80，酵母粉50，酵母膏30，玉米浆22，CoCl2・6H2O 0003，淀粉酶00025，pH70～72，用自来水配制。

1.4 诱变及筛选方法。

; 1.4.1 紫外线诱变 取制备好的菌悬液5ml移入直径为90mm的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，功率20W，波长254nm紫外灯下30cm处打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为15、30、45、60和75s，可以累积照射，也可分别照射不同时间。取不同照射时间段的菌悬液1ml，进行10—1、10—2、10—3、10—4、10—5、10—6和10—7梯度稀释，取10—3、10—5、和10—7浓度的稀释液各01ml涂布于分离平板上，用黑纸包严，28℃倒置培养7～9d。

; 1.4.2 亚硝基胍(NTG)诱变 用01mol/L，pH60的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为108个/ml，分别用1、2、3和4mg/ml浓度的NTG处理紫外诱变后的突变株单孢子悬液，于28℃震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，经稀释后涂布于分离平板28℃倒置培养7～9d。

; 1.4.3 甲硫氨酸(Met)诱变 将不含甲硫氨酸的斜面培养基20ml倒入培养皿中，待凝固后倒入10ml含有不同浓度的Met斜面培养基，终浓度分别为025、050、10mg/ml。处理后的孢子悬液稀释后涂布于平板上，28℃倒置培养7～9d［3］，挑取优势单菌落转接于斜面，28℃温箱培养。

; 1.5 摇瓶发酵从平板上挑取灰色丰满的单菌落转接于斜面，28℃培养7～9d，将长出丰富的灰色孢子转接于种子培养液，220r/min，28℃摇床培养28～30h，接种5%于发酵培养液(250ml三角瓶，装50ml发酵液)，220r/min，28℃摇床培养7～9d，放瓶测定效价。