白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响
作者：高宝安，陈世雄，杨俊，黄骥，邓红艳。
【摘要】 目的探讨白花蛇舌草乙醇提取物在体外对肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT法测定不同浓度白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞增殖的影响；Hoechst 33258检测白花蛇舌草乙醇提取物作用后细胞凋亡情况；流式细胞仪检测药物作用后的细胞周期和凋亡率；Western Blot 检测药物作用后的Bax和Bcl—2蛋白的表达。结果白花蛇舌草乙醇提取物抑制A549细胞增殖呈时效和量效关系；Hoechst 33258检测白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞后可见凋亡细胞；40 mg/ml白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞12，24，36，48h，药物组G1～G0期细胞百分比分别为（42.82±3.95）%，（51.84±6.37）%，（54.76±8.85）%和（64.94±7.56）%，药物组细胞凋亡率分别为（5.72±0.98）%，（7.10±2.08）%，（19.89±4.25）%，（32.55±6.51）%，均高于对照组（P均﹤0.05），且G1～G0期细胞百分比和凋亡率随药物作用时间增加而增加；Western Blot显示，白花蛇舌草乙醇提取物作用A549细胞，Bax的表达随作用时间增加而增加，Bcl—2的表达随作用时间增加而减低。结论白花蛇舌草乙醇提取物随着药物浓度和作用时间的增加对肺腺癌A549细胞的体外抑制效应增加；其抑制作用可能通过将细胞周期阻滞于G1～G0期和通过上调Bax和下调Bcl2的表达而诱导细胞凋亡来实现的。
【关键词】 白花蛇舌草乙醇提取物 细胞周期 凋亡 人肺腺癌A549细胞。
原发性支气管肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一。近30年来，其发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势。肺腺癌在原发性支气管肺癌中极为常见，传统化疗和放疗对肺腺癌效果均不甚理想［1］。白花蛇舌草Hedyotis diffusa 为茜草科耳草属植物。中医以其全草入药，性寒，味甘淡，归心、肺、肝、大肠经；清热解毒，利尿；主治恶疮肿毒、泻痢等症，临床常用于治疗各类癌症［2］。研究表明［3］，不同工艺白花蛇舌草提取物抗肿瘤作用有差异：乙醇提取物＞冷水提取物＞煎煮提取物。我们通过研究白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，揭示白花蛇舌草抗肺腺癌可能的作用机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法。
1.1 药物和试剂。
白花蛇舌草购于湖北省药材公司。取白花蛇舌草全草50 g，粉碎研磨，95%乙醇搅拌浸泡15 d，滤去残渣，水浴至液体全部蒸发干，而后加入ddH2O 50 ml溶解，得到生药浓度为1 g/ml，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存，用前用DMEM培养基稀释至所需浓度。碘化丙啶（PI）购于Pharmingin公司（晶美公司代理）。Hochest33258购于Sigma公司。鼠抗人Bax、Bcl—2及β—actin单抗购自美国Santa Cruz公司。
1.2 细胞及其培养。
肺腺癌细胞株A549购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，用含10％小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的DMEM培养基（Gibco公司），在含5％CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。
1.3 MTT试验。
A549细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为1×105 ml—1，接种于96孔板，每孔100 μl。分设对照组和不同浓度药物组（5，10，20 ，40 ，80 mg/ml），每孔设6复孔，分别培养1，2，3，4 d；每孔加入5 g/L MTT10 μl，继续孵育4 h，每孔加入200 μl二甲基亚砜（DMSO）终止，振荡15 min，450型ELISA—Reader酶标仪（Bio—Rad公司）570 nm主波长，630 nm副波长检测吸光度。以对照组细胞活力为100％，按公式计算不同浓度白花蛇舌草乙醇提取物对A549细胞增殖的抑制率：细胞抑制率（%）＝(1－药物组吸光度/对照组吸光度)×100％。
根据MTT实验结果，选择40 mg/ml的白花蛇舌草乙醇提取物作为后续实验药物浓度。将干净无菌的盖玻片置于六孔板内，接种细胞过夜。当50％～80％满时，加入白花蛇舌草乙醇提取物作用12，24，36，48 h后，吸尽培养液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min。然后去固定液，用PBS洗两次，3 min/次，吸尽液体，加入0.5 ml Hoechst33258染色液（1 mg/ml），染色5 min，晃动数次，封片，荧光显微镜下观察。