肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率

作者：赵增仁,李勇,田延峰,张丽静，张峰，李芳 【摘要】目的：探讨胃癌细胞抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导T淋巴细胞(Tlymphocyte)增殖和杀伤胃癌细胞的效率.方法：应用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞，经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）、重组人白细胞介素4（rhIL4）和肿瘤坏死因子α（TNFα），体外诱导培养获取成熟DC，流式细胞术检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表型；同时经重组人白细胞介素2（rhIL2）诱导扩增T淋巴细胞，检测CD3，CD4，CD8及CD56表型.以人胃癌OCUM2MD3细胞株冻融抗原致敏DC，然后刺激T淋巴细胞，得到肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）.MTT法检测致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响和致敏DC活化的特异性CTL对胃癌细胞的体外杀伤效率.结果：体外诱导人外周血单个核细胞，可获得大量形态典型、具备强烈刺激增殖能力、且高表达CD80，CD86的DC及高表达CD3的T淋巴细胞；MTT法检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC组刺激T淋巴细胞增殖指数显著高于未致敏DC组和对照组(P0.01)；流式细胞术检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC主要刺激T淋巴细胞增殖为CD8+的CTL（60.58±8.43）%，经胃癌细胞抗原致敏DC刺激后，对胃癌细胞的杀伤效应显著增加，致敏DC组对胃癌细胞杀伤活性（71.57±4.83）%，较未致敏DC组（12.53±1.62）%和单纯T淋巴细胞组（10.45±1.40）%作用更为显著（P0.01）,而且随着效靶比增加，其杀伤效应亦显著增加.结论：胃癌细胞抗原致敏DC可显著刺激T淋巴细胞增殖为CD8+CTL，进而发挥其高效杀伤胃癌细胞的作用. 【关键词】树突细胞；T淋巴细胞；胃肿瘤；T淋巴细胞，细胞毒性 　　0引言 　　树突状细胞（dendriticcells,DC）是专职的抗原提呈细胞，与机体抗肿瘤免疫关系密切［1］.DC加工处理提呈抗原信息后，通过激活T淋巴细胞而发挥抗肿瘤细胞的免疫效应.研究［2］表明，各种人DC前体细胞如脐血、骨髓及外周血CD34+细胞或CD14+细胞等在联合应用GMCSF，IL4，TNFα等因子体外培养下，均可诱导成为成熟DC.在多种肿瘤的临床试验中，发现DC免疫治疗具有一定的效果［3］.我们以人外周血为DC来源，利用胃癌细胞冻融抗原致敏DC，观察其诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphotytes，CTL）对胃癌细胞的杀伤效率，为DC治疗胃癌提供实验依据. 　　1材料和方法 　　1.1材料人胃癌高侵袭OCUM2MD3细胞株，由日本大分医科大学外一科八代正和教授惠赠.外周血取自健康志愿者.重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF），重组人白细胞介素4（rhIL4），白细胞介素2（rhIL2）和重组人肿瘤坏死因子α（rhTNFα）（美国Cytolab公司）；抗人CD3PE，CD4PE，CD8PE和CD56PE（美国BectonDickinson公司）；四甲基偶氮唑蓝（美国Sigma公司）；抗人CD83PC5，CD86PE，CD80FITC和HLADRFITC（美国BECKMANCOUNTER公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1DC分离培养及鉴定应用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,以rhGMCSF和rhIL4诱导培养5d后，加入TNFα，于第7日收集DC，光镜及电镜下观察其形态.同时分别加入荧光标记的CD83PC5，CD80FITC，CD86PE和HLADRFITC，间接免疫荧光染色，采用文献［4］的方法，流式细胞仪检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表达. 　　1.2.2胃癌细胞冻融法制备抗原致敏DC胰蛋白酶消化、吹打收集对数生长期的人胃癌OCUM2MD3细胞，调整细胞数为2×107/mL.将人胃癌OCUM2MD3细胞以液氮反复冻融法［5］制备肿瘤抗原.DC培养至第5日加入胃癌细胞抗原，第7日加入TNFα，第8日收获胃癌OCUM2MD3细胞抗原致敏的DC. 　　1.2.3MTT法检测致敏DC诱导T淋巴细胞增殖将胃癌细胞抗原致敏DC,未致敏DC和T淋巴细胞，经60Co照射灭活，分别取1×103，3×103，1×105接种于96孔培养板，分为致敏DC组、未致敏DC组和T细胞组.每孔加入1×105T淋巴细胞，终体积为200μL.混合培养96h后，加入MTT溶液20μL，继续静置培养4h后，吸弃培养基，加入DMSO150μL，均匀震荡混匀10min，自动酶标仪于波长492nm处测定吸光度A值，空白培养基孔作为对照，按下面公式计算刺激增殖指数(SI).SI=各刺激组孔A492nm/空白孔A492nm. 　　1.2.4MTT法检测CTL对胃癌细胞的体外杀伤效应将负载胃癌抗原DC,未负载胃癌抗原DC分别取2×104个细胞与T淋巴细胞混合后及单纯T淋巴细胞置于48孔培养板上，分为致敏DC组、未致敏DC组、T细胞组，以人胃癌OCUM2MD3细胞为靶细胞，另设单独效应细胞组和单独靶细胞组.按效靶比10∶1，20∶1，40∶1加入人胃癌OCUM2MD3细胞的培养液，静置培养24h.每孔加入MTT溶液200μL，孵育4h后全自动酶标仪于492nm波长处测定A值.杀伤活性按下式计算：杀伤活性(%)=｛1［（实验组A值—单独效应细胞组A值）/单独靶细胞A值］｝×100%. 　　1.2.5流式细胞术检测T淋巴细胞表型收集T淋巴细胞（T细胞组）和经胃癌细胞抗原致敏DC刺激扩增的T淋巴细胞（致敏DC组），制备单细胞悬液，调整细胞数为5×106/mL，加入藻红蛋白标记的CD3，CD4，CD8及CD56荧光抗体孵育30min后，流式细胞仪检测CD3，CD4，CD8及CD56的表达量. 　　统计学处理：数据结果以x±s表示，选用SPSS11.5统计软件，采用t检验和方差分析进行统计分析，P0.05为差异具有统计学意义. 　　2结果 　　2.1体外培养的DC形态人外周血单个核细胞经rhGMGSF,rhIL4联合诱导7d后,光镜下观察细胞表面有毛刺状突起；扫描电镜(SEM)观察DC表面粗糙，胞体向四周伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起，有的突起末梢呈球状膨大，众多突起甚至遮盖了胞体，充分展示出DC的典型形态特征；透射电镜(TEM)下成熟DC的胞体较大，可见明显的突起,胞浆细胞器较发达（图1）. 　　2.2DC细胞表型分析培养7d时，收获的细胞以成熟DC为主.流式细胞术检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表型，结果发现CD80，CD86的阳性细胞比率分别为（43.81±6.19）%和（51.07±4.32）%，CD83阳性细胞比率可达（61.94±5.87）%，HLADR达（72.26±7.65）%（图2）. 　　2.3T淋巴细胞经胃癌细胞抗原致敏DC刺激前后改变获得T淋巴细胞于镜下观察可见细胞体积较小呈圆形，符合典型淋巴细胞的形态.经胃癌细胞抗原致敏DC刺激后，T淋巴细胞形态无明显变化，数量明显增多，流式细胞术检测其CD3的表达率为（99.45±0.35）%（图3）. 　　A：光镜下见DC表面有毛刺状突起×400；B：扫描电镜下见DC表面有大量皱褶和树状突起×3500；C：透射电镜下见DC表面有明显突起，胞浆细胞器较发达×3500. 　　图1培养7dDC形态（略） 　　图2DC表面分子表型（略） 　　A：DC刺激前T淋巴细胞；B：DC刺激后T淋巴细胞. 　　图3T淋巴细胞变化×200（略） 　　2.4胃癌细胞抗原致敏DC对人外周血T淋巴细胞增殖的影响MTT检测结果显示，致敏DC组SI值为(57.3±11.5)%，显著高于未致敏DC组（18.3±7.4）%,T细胞组（18.5±2.6）%和对照组（17.6±5.3）%，差异具有统计学意义（P0.01）.未致敏DC组、T细胞组和对照组之间差异无统计学意义（P0.05）.