微囊藻毒素LR促肝癌过程p53、p16基因mRNA表达
作者：胡志坚, 陈华, 庞春艳, 郑玲, 林奇英。
【关键词】 藻毒素类;,γ。
摘要:目的 探讨微囊藻毒素LR(MCLR)促肝癌的分子机制。方法 采用二阶段致癌理论建立中期试验动物模型,γ谷氨酰转肽酶(γGT)染色检验MCLR的促癌作用,并以RTPCR结合图像分析技术精确测定大鼠肝脏p53和p16基因的表达情况。 结果 (1)MCLR在促大鼠肝癌过程中能显著增加γGT阳性率。(2)MCLR在促大鼠肝癌过程中能显著增加大鼠肝脏p53 mRNA表达强度,而对p16 mRNA表达强度没有影响。结论 调节p53表达可能是MCLR促癌过程的重要机制。
关键词: 藻毒素类; γ谷氨酰转移酶; 毒素类; 基因,p53; 基因,p16; 肝肿瘤。
ABSTRACT: Objective To explore the molecular mechanism of microcystinLR(MCLR) inducing of liver tumor. Methods Acording two stagemediumterm theory to set up the animal model, and biochemistry technique to detect the carcinogenesis of the model.RTPCR technique and image analysis were used to study the mRNA expression of the p53 and p16 in the course of inducing tumor. Results (1)MCLR can enhance the positive reaction of γGT. (2)MCLR increased the expression of p53, and have not effect on the expression of p16. Conclusion (1)MC can induced liver tumor formation strongly. (2)The high expression of p53 may play an important role in the carcinogenesis of MCLR in liver.
KEY WORDS: microcystins; γglutamyltransferase; toxins; genes,p53; genes,p16; liver neoplasms 当前随着全球环境的不断恶化,水体中有毒的藻类对人类健康的影响也越来越受人们的关注。饮水中以微囊藻毒素(microcystin,MC)为代表的藻类毒素已被公认为引起肝癌的三大主要环境因素之一[1]。MC是一种特征性的肝毒素,其中以分布广且肝毒性明显的微囊藻毒素LR(MCLR)为其主要代表物。已有研究表明,福建同安肝癌高发与存在MCLR有关[2]。许多研究表明，基因表达的改变与肿瘤发生密切相关,为进一步了解MCLR在肝肿瘤发生过程中的作用和机制,笔者选择与调节细胞周期密切相关的p53和p16基因进行研究,通过分析它们在藻类肝毒素促肝癌过程mRNA表达的变化,从而进一步明确MCLR的促癌的机制。
1 材料和方法。
1.1 材料。
1.1.1 动物 Wistar大鼠(中科院上海实验动物中心;合格证号:中科动管第005号)5周龄,雄性,45只。
1.1.2 试剂。
二乙基亚硝氨(DEN,南京土壤研究所),200 mg/kg腹腔注射。MCLR纯毒素(美国Sigma公司),20 μg/kg腹腔注射。RNA提取用Trizol mRNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司),cDNA合成用试剂盒(SuperScriptTM FirstStrand Synthesis Systern for RTPCR,美国Invitrogen公司)。γL谷氨酰α萘胺、双甘氨肽和固浆紫(上海化学试剂公司)。
1.1.3 藻水。
在9月份藻类繁殖高峰时用25号浮游生物网采集福建同安汀溪水库的藻细胞,经镜检60%为微囊藻。MC培养基培养,取其培养液作样本,经上海第一医科大学预防医学研究所ELISA法检测,该藻水中含MC 529.656 ng/L。
1.2 方法。
1.2.1 二阶段试验。
大鼠随机分成4组,正常饲养1周后,3组给予DEN 200 mg/kg腹腔注射1次,1组等容量生理盐水腹腔注射(空白对照组)。第3周末,4组大鼠均行2/3肝切除。第4~10周,DEN+纯毒素组MCLR纯毒素20 μg/kg腹腔注射,DEN对照组和DEN+藻水组等容量生理盐水腹腔注射。在此期间,DEN+藻水组饮用藻水,另3组饮用自来水。DEN对照组与DEN+纯毒素组各1只死亡。第10周末处死动物,取肝脏做HE染色、γGT染色和RTPCR。
1.2.2 γGT染色。
取γL谷氨酰α萘胺和双甘氨肽各20 mg溶解于0.1 mol/L(pH 7.2)磷酸缓冲液16 mL作为甲液;称取固浆紫24 mg溶解于生理盐水24 mL作为乙液。甲乙两溶液混合过滤制备成染液,将染液倒入染色缸并置于37 ℃水浴10 min,将冷冻肝组织切片与水浴中的染液作用30~60 min,取出用蒸馏水清洗,然后在2%CuSO4浸洗2 min,蒸馏水再次漂洗。最后苏木精染色,甘油明胶封固。以正常小鼠肾脏作阳性对照,在光镜下观察肝细胞浆,以染成桔红色为阳性。
1.2.3 反转录聚合酶反应。
以组织标本100 mg∶TrizolTM 1 mL的比例将肝癌组织溶于TrizolTM中,立即于室温研磨混匀,加入氯仿200 μL剧烈震荡15 s,室温下静置2~3 min,于4 ℃、7000 r/min离心15 min。提取上清即为肝癌组织的总RNA,经SuperScript TrizolTMⅡRT反转录为cDNA。取cDNA 2 μL于25 μL反应体系中进行PCR反应(引物与条件见表1)。每个反应包括不加cDNA模板的阴性对照。PCR反应完成后,取PCR产物5~10 μL进行电泳鉴定,于1.5%~2%琼脂糖凝胶,10 V/cm凝胶的电压下电泳。凝胶成像系统拍照,ImagePro Plus图像分析软件对目的基因及内参物电泳条带进行积分光密度(integral opticaldensity,IOD)测定,用目的基因吸光度与GAPDH光密度比值代表目的基因的相对表达含量。表1PCR扩增引物（略）。
1.3 统计学处理。
利用SPSS 12.0统计软件的精确概率法、方差分析、LSD法对数据分析。