姜黄素、姜黄素与大黄素联用抗肝纤维化作用的实验研究
【摘要】 目的探讨姜黄素、姜黄素与大黄素联用的抗肝纤维化作用。方法以二甲基亚硝胺（DMN）诱导大鼠肝纤维化模型，造模结束后，分别给予姜黄素、姜黄素与大黄素联用（简称姜大联用）进行治疗，检测肝功能、肝纤维化血清学指标，肝组织SOD、MDA和Hyp水平，取肝组织固定，HE、VG胶原染色，光镜观察肝组织的病理变化以及α—平滑肌（α—SMA）在肝脏的表达。结果姜黄素、姜大联用能明显降低肝纤维化大鼠血清ALT，AST，TNF—α，HA，LN，PCIII含量，降低肝组织MDA、Hyp含量，升高SOD水平。病理组织观察表明，姜黄素、姜大联用能减轻肝细胞坏死，抑制纤维组织增生，改善肝组织结构，抑制α—SMA在肝内的表达。结论姜黄素、姜大联用具有良好的抗肝纤维化作用。
姜黄素、大黄素分别是温郁金、姜黄和虎杖的所含成分之一。姜黄素具有广泛的药理活性，能抗氧化、抗炎，抑制肝星状细胞的活化和增殖，而大黄素亦有上述作用。初步研究表明，姜黄素、大黄素能预防肝纤维的形成，以郁金、虎杖为主组成的复方虎金颗粒［1］具有良好的抗肝纤维化作用。为阐明中药复方产生效用的物质基础，我们探讨了姜黄素、姜黄素与大黄素联用对肝纤维化的治疗作用。
1 材料。
1.1 动物SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重（200±20）g，购自广州中医药大学实验动物中心，普通大鼠饲料喂养。
1.2 药物姜黄素（Curcumin）、大黄素（Emodin），均购自陕西旭煌植物科技有限公司，经HPLC检测纯度达90%以上，使用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制成不同浓度的混悬液。水飞蓟素（Silymarin，利加隆140胶囊），德国马博士大药厂生产，临用时用蒸馏水配成2.4mg/ml的供试品液。
1.3 试剂DMN购自日本株式会社，使用前用生理盐水配成0.5%溶液备用。HA，LN，PCIII由北京北方生物技术研究所提供；TNF—α测试盒由北方生物试剂研究所提供；SOD，MDA，Hyp，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。甲醛、苏木素、伊红、酸性品红、戊二醛等。
1.4 仪器7060型全自动生化分析仪、SN—695B型放免γ测量仪，上海原子核研究所日环仪器厂。UV—754型分光光度计，BX50显微镜，Olympus 公司，2035石蜡切片机，德国Walldorf 公司；E 990数码摄像机，Nikon公司。
2 方法。
2.1 分组、造模及给药随机取SD大鼠8只为正常对照组。其它大鼠进行造模。将1 ml DMN原液溶于200 ml生理盐水中，配制0.5%DMN溶液，避光保存，2周内使用。参照文献［2］给药，每只大鼠给予0.5%DMN（2 ml/kg）腹腔注射，第1周前3 d连续给2/3药量，后4 d不给药，第2周开始前3 d连续给全药量，后4天不给药，持续4周。正常对照组则给予相同量的生理盐水腹腔注射。造模结束后，将存活的大鼠随机分为6组，分别为模型对照组、水飞蓟素组、姜黄素高、低剂量组和姜大联用高、低剂量组,每组8只。正常对照组和模型对照组灌胃蒸馏水，水飞蓟素组用药量分别为人临床剂量的5倍，即0.024 g/kg，姜黄素给药剂量为100 mg/kg和200 mg/kg，姜大联用剂量分别为50，10和100，20 mg/kg。灌胃1次/d，每周灌6 d。治疗4周后，实验结束。眼眶采血，分离血清，留取肝左叶固定。
2.2 观察指标及方法①观察大鼠一般状态包括：饮食变化、行为及毛发改变等；②全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT，AST，TP，ALB，A/G；③放免法检测HA，LN，PCIII，TNF—α含量；④肝组织标本HE和VG胶原染色，光镜观察；⑤α—SMA免疫组化染色：常规SABC法染色，DAB显色。
2.3 肝胶原增生程度、肝纤维化分级采用Ishak法［3］0级：无肝纤维化；1级：纤维组织向部分汇管区扩大，伴有小纤维间隔；2级：纤维组织向大部分汇管区扩大，并伴有小纤维间隔；3级：纤维组织向汇管区扩大，并伴汇管区与汇管区桥接；4级：纤维组织向汇管区延伸，并有明显的汇管区与汇管区、汇管区与中央小叶区桥接；5级：纤维形成明显的汇管区与汇管区、汇管区与中央小叶区桥接，间或有假小叶形成；6级：肝内布满小圆形假小叶，假小叶内有粗大增生的胶原纤维（肝硬化）。
2.4 统计方法计量资料以均数±标准差±s表示，采用F检验，两两比较用q 检验，用统计软件SPSS11.0进行分析；计数资料采用Ridit分析。
3 结果。
3.1 姜黄素、姜大联用对大鼠一般情况的影响正常对照组大鼠生长状态良好，体重增加显著，皮毛光滑，二便如常；大鼠注射DMN后，活动少，精神萎靡，喜睡少动，体重不增加甚至较前下降，尿黄，有腹泻，大鼠发生腹水产生率达70%。经姜黄素、姜大联用治疗后大鼠一般状态明显好于模型组，腹水的发生率明显降低。
3.2 姜黄素、姜大联用对肝纤维化大鼠血清ALT，AST，TP，ALB，A/G的影响结果如表1。 从表1可以看出，经DMN造模后，大鼠血清中ALT、AST的含量升高，TP，ALB，A/G的含量明显下降，与正常对照组比较均差异显著（P0.01）；经姜黄素、姜大联用治疗后，各组大鼠血清中ALT及AST的水平有不同程度降低，TP、ALB、A/G均有升高，与模型组比较有显著性差异（P0.05或P0.01），且存在一定的量—效关系。
3.3 姜黄素、姜大联用对肝纤维化大鼠血清PCIII，HA及LN，TNF—α含量的影响 结果见表2。
表1 姜黄素、姜大联用对肝纤维化大鼠血清ALT，AST，TP，ALB及A/G的影响（略）。
与正常对照组比较，**P0.01；与模型组比较，ΔP0.05,ΔΔP0.01；n=8。
表2 姜黄素、姜大联用对大鼠血清PCIII，HA，LN，TNF—α含量的影响（略）。
与正常对照组比较，**P0.01；与模型组比较，ΔP0.05,ΔΔP0.01；n=8 从表2可以看出，使用DMN造模后，各组大鼠血清中HA，LN，PCIII，TNF—α含量明显升高，与正常对照组比较有显著性差异（P0.01）；经姜黄素、姜大联用治疗后，大鼠血清中HA，LN，PCIII，TNF—α明显降低，与模型组比较，差异显著（P0.05或P0.01）。
3.4 姜黄素、姜大联用对大鼠肝组织SOD，MDA，Hyp含量的影响结果见表3。
表3 姜黄素、姜大联用对大鼠肝组织SOD，MDA，Hyp含量的影响（略）。
与正常对照组比较，**P0.01；与模型组比较，ΔP0.05,ΔΔP0.01；n=8 从表3看出，DMN造模后，各组大鼠肝组织中MDA及Hyp的含量明显升高，SOD的含量降低，与正常对照组比较有显著性差异（P 0.01）；经姜黄素、姜大联用治疗后，各治疗组大鼠肝脏组织中MDA、Hyp的含量降低明显，SOD含量上升，与模型组比较差异显著（P0.05或P 0.01）。