蛋白酶体抑制剂硼替佐米对小鼠树突状细胞的免疫调节作用研究分析

摘　要：探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对小鼠树突状细胞的免疫调节作用，从而促使其更加广泛应用于抗肿瘤治疗。方法：制备小鼠骨髓来源的树突状细胞，用CCK—8法检测硼替佐米对DC的抑制作用，流式细胞术检测DC表面共刺激分子的表达，ELISA法检测DC培养上清及MLR上清液中的细胞因子表达。结果：硼替佐米能够以时间、剂量依赖方式抑制DC的生长。结论：作为蛋白酶体抑制剂，硼替佐米是能够对小鼠树突状细胞产生一定的影响。

关键词：蛋白酶体抑制剂；硼替佐米；树突状细胞；免疫调节 　　硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，经体内外实验研究证实，对多种肿瘤细胞系均有抑制作用，现已成为多发性骨髓瘤治疗的一线用药，对套细胞淋巴瘤也有良好的治疗效果[1]。近年来，人们发现其对免疫细胞如T细胞、NK细胞等均具有抑制作用，研究硼替佐米对小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）的免疫调节作用，现将结果报告如下。　　1 资料与方法　　1.1 一般资料：选取SPF级C57BL/6小鼠（雄性，6～8周龄），购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，体重18～22 g，层流环境下无菌饲养，每天紫外线照射消毒，饲养笼、食物、饮水均经高压消毒。　　1.2 药物与试剂：硼替佐米（杨森公司）用磷酸盐缓冲液（PBS）配置成2.5 mmol/L溶液，避光，于－70℃分装保存，使用前用无血清的PRMI1640培养基稀释为所需浓度。重组小鼠粒—巨噬细胞集落刺激因子（rmGM—CSF）购于杭州隆基生物制品公司，重组小鼠IL—4（rmIL—4）购于PeproTect公司。CCK—8试剂盒为日本同仁化学研究所产品；流式细胞检测所需荧光抗体均购于BD公司；ELISA试剂盒购于达科为公司。EMSA试剂盒为唯奥基因公司产品。　　1.3 小鼠骨髓来源的树突状细胞（Dendritic cell，DC）的制备：颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨及胫骨，用1 ml注射器抽取无血清的PRMI1640培养基冲出骨髓细胞，用红细胞裂解液（0.15 mol/L NH4Cl，0.01 mmol/L KHCO3，0.1 mmol/L EDTANa2）去除红细胞并洗涤后，培养在含10%胎牛血清（GIBCO公司产品）、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺及10 ng/ml rmGM—CSF、1 ng/ml rmIL—4的PRMI1640培养基内，于37℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养。48 h后，轻轻吹打细胞，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM—CSF及rmIL—4。隔日半量换液，培养至第6天。收集悬浮细胞，按照实验设计进行分组，分别加入脂多糖（LPS）或/和不同浓度的硼替佐米。 毕业论文 　　1.4 CCK—8法检测硼替佐米对DC的抑制作用：于DC培养的第6天，离心收集悬浮细胞，以5×105/ml的密度接种于96孔板，加入不同浓度的硼替佐米，同时设空白对照组，置37℃、饱和湿度、5% CO2的恒温孵箱中培养24 h、48 h及72 h后，加入CCK—8试剂10 μl继续培养4 h，用酶标仪在450 nm处读取吸光度。　　1.5 统计学处理：实验数据用SPSS 18.0程序进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（）表示，若是正态分布，用方差分析，组间、组内比较；若是非正态分布，用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。　　2 结果　　在培养DC的第6天收集悬浮细胞，重新铺24孔板，分别加入不同浓度硼替佐米作用24 h、48 h及72 h后用CCK—8法检测硼替佐米对DC的抑制作用，发现随着硼替佐米浓度与时间的增加，DC的抑制率也在不断增加，呈现指数性表达形式，其中作用24 h最高抑制率为62.5%，作用48 h的最高抑制率为80.0%，作用72 h的最高抑制率也为80.0%。但是作用72 h在20 nm的浓度下就可以达到最高抑制率，而作用48 h需要在50 nm的浓度下达到最高抑制率。表明硼替佐米能够以时间、剂量依赖方式抑制DC的生长。详见图1。　　图1 硼替佐米对DC的抑制作用。

毕业论文 　　3 讨论　　真核细胞内蛋白的有序降解对细胞的功能、生存极为重要。目前发现真核细胞内有多条蛋白质降解途径，其中最主要的是泛素－蛋白酶体通路，80%真核生物的蛋白质降解受控于该通路。蛋白酶体是一种细胞功能的关键性调节因子，与许多细胞内蛋白的降解有关，从而在一些生理过程如细胞周期、信号传导、应激反应以及基因转录等中维持细胞的自身稳定[2]。我们知道，成熟的树突状细胞对于诱导免疫反应非常重要，而未成熟或者“半成熟”的DC可以诱导免疫耐受。树突状细胞的成熟与否取决于其表面标志及功能的不同。在未成熟阶段，DC存在于外周组织中，当摄取了抗原或者炎性介质或者微生物的刺激后，就向成熟状态转化[3]。　　硼替佐米（Bortezomib，PS—341，商品名万珂）是第一个应用于临床的蛋白酶体抑制剂，对多种人类肿瘤细胞系及原代培养的肿瘤细胞均有抗肿瘤活性[4]。美国药品与食品委员会已批准硼替佐米用于临床治疗复发和难治的MM及套细胞淋巴瘤。树突状细胞（Dendritic cell，DC）是目前已知体内最重要的抗原提呈细胞，而且也是唯一能激活初始型T细胞的APC，在特异性免疫应答的诱导中具有独特地位。DC不仅是诱发机体免疫应答的有力启动者，而且在移植免疫中对排斥和耐受起着双向调节作用。文章结果显示，在培养DC的第6天收集悬浮细胞，重新铺24孔板，分别加入不同浓度硼替佐米作用24 h、48 h及72 h后用CCK—8法检测硼替佐米对DC的抑制作用，发现硼替佐米能够以时间、剂量依赖方式抑制DC的生长。 毕业论文 　　总之，作为蛋白酶体抑制剂，硼替佐米是能够对小鼠树突状细胞产生一定的影响。参考文献：[1] Hideshima T,D Chauhan,T Hayashi,et al.Proteasome inhibitor PS—341 abrogates·6 triggered signaling cascades via caspase dependent down regulation of gpl30 in multiple myeloma[J].Oncogene,2003,22(52):8386.[2] Hideshima T,C Mitsiades,M Akiyama,et al.Molecular mechanisms mediating antimyeloma activity of proteasome inhibitor PS—341[J].Blood,2003,101(4):1530.[3] Zhu H,L Zhang,E Dong,et al.Bik/NBK accumulation correlates with apoptosis—induction by bortezomib(PS—341,Velcade) and other proteasome inhibitors[J].Oncogene,2005,24(31):4993.[4] Schultz RM.Potential of p38 MAP kinase inhibitors in the treatment of cancer[J].Prog Drug Res,2003,60(2):59.