免疫防龋的研究新进展
龋病被认为是人类最普遍的感染性疾病。
早在60年代末期，国外学者即开始了防龋疫苗的探索，期望通过接种某种防龋疫苗，有效地阻止致龋菌在宿主口内的粘附与定殖，达到预防龋齿的目的。
近年来，运用免疫学手段控制龋病更为其研究的热点。
一、主动免疫防龋研究 主动免疫是用人工接种的方法给机体输入抗原性物质，刺激机体免疫系统产生免疫应答，从而提高机体抗病能力。
在主动免疫防龋研究过程中，存在着一些障碍，主要包括三个方面：①变形链球菌（简称变链菌）等致龋菌一般定殖在宿主组织表面，在这些部位难以激发有效的免疫反应；②抗变链菌抗体能与机体组织蛋白特别是心脏组织发生交叉反应，产生免疫复合物介导的疾病如细菌性心内膜炎；③变链菌与口内其他链球菌具有交叉反应性抗原，防龋疫苗介导的免疫反应可能破坏口内正常菌群的生态平衡。
因此，多年来学者们一直致力于通过改变免疫原、免疫途径、免疫佐剂和免疫频率等手段，寻找一种安全有效的防龋疫苗。
1．全菌疫苗：早期的防龋疫苗研究，主要是利用变链菌全细胞制备灭活死疫苗和减毒活疫苗。
通过对大鼠、猴等实验动物的免疫研究发现，免疫后的动物唾液和血清中抗变链菌抗体水平明显升高，能有效地抑制变链菌在牙面的聚集，降低龋病的发生率。
这一时期的研究充分表明，利用变链菌全细胞多价疫苗可防止龋病的发生。
但进一步研究显示，与其他链球菌相似，变链菌某些抗原或成分可诱发与人心脏组织发生交叉反应的抗体。
2．纯抗原亚单位疫苗：80年代开始，随着对变链菌细胞壁各种抗原性多聚物的逐渐认识，免疫防龋转入以变链菌单一抗原成分制备亚单位防龋疫苗的研究。
研究的焦点集中于两种候选疫苗，即变链菌主要表面蛋白抗原（pAc或agⅠ／Ⅱ、pl、spaA等）和葡糖基转移酶（gTase），它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖过程中起着重要作用。
近10年的大量研究证实，用pAc和gTase主动免疫能明显抑制实验动物和自愿受试者牙面变链菌的粘附和龋病发生率，且纯化的抗原不会介导心脏交叉反应。
但研究者发现，由于纯抗原免疫原性较弱，单一免疫常难以同时激发有效的系统和局部免疫反应。
因此，学者们尝试了经口服、鼻内注射、皮下注射和腹腔注射等多种途径并加以佐剂进行免疫。
将pAc或gTase制备成微乳化的脂质体疫苗，不仅经济、简便，且能激发有效的血清和唾液抗变链菌抗体，明显抑制实验动物龋齿的发生。
将pAc或gTase与霍乱毒素b亚单位（cTB）制备成嵌合疫苗，也是增强抗原免疫性的有效手段，能激发有效的循环抗体和局部粘膜反应。
我们（1996）将pAc与弗氏佐剂乳化后，给bALB／c小鼠皮下注射，结果显示，免疫组血清特异性igG和唾液特异性igA抗体水平显著升高。
葡聚糖结合蛋白（gBPs）也被证实为有效的候选疫苗。
smith等（1996）将gBP59给大鼠唾液腺周围皮下注射，明显抑制了鼠牙的光滑面及窝沟龋的发生。
3．多肽疫苗：自90代年以来，随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，从分子水平对变链菌pAc和gTase的认识逐步深入。
目前，编码这两种抗原的基因pac和gtf已被克隆，核苷酸序列已基本清楚。
用pAc和gTase分子中与某特定功能相关并具有免疫原性的核酸序列制备多肽防龋疫苗，已成为免疫防龋研究的热门。
目前研究证实，pAc分子的n末端唾液结合区（sBR）、粘附功能区（816～1213位残基）、a区的t细胞和b细胞抗原决定簇等；gTase分子的氨基末端的酶促区（cAT）、羧基末端的葡聚糖结合区（gLU）和高度保守的酶活性片段（gGY和aND）等是理想的候选多肽。
由于多肽疫苗仅为病原体的单一保护性抗原或某一抗原决定簇，单纯以游离的多肽免疫动物，常不能产生理想的免疫效果，也需将其结合至大分子载体上以增强其免疫原性。
将pAcSBR与cT—B嵌合并以cT为佐剂，经鼻内免疫大鼠，可激发高水平的唾液抗pAcIgA抗体，并导致实验动物龋活性下降。
以sBR与cTA2／b嵌合口服免疫小鼠，也能激发高水平的特异性唾液sIgA和血清igG抗体。
另外大肠杆菌的热不稳定毒素b亚单位（lT—B）也被证实能增加连接的spaA多肽的免疫原性和生物学活性。
senpuku等（1996）发现将pAc分子的两个肽段联接后免疫动物，比分别用单一肽段免疫所激发的抗rPAc抗体明显升高。
smith等（1997）将gTF酶活性片段gGY和aND以赖氨酸为核心分别构建有8条支链结构的多肽疫苗，经唾液腺周围免疫大鼠，结果显示，将抗原决定簇设计成这种结构具有高度的免疫原性，能诱导高水平的特异性唾液igA抗体，并使动物龋齿发生率显著降低。
4．基因重组疫苗：利用遗传工程技术，将致龋菌毒力因子的结构基因克隆至载体质粒，构建基因重组防龋疫苗，也是很有应用潜力的免疫防龋手段之一。
选择安全无毒的载体细菌是基因重组防龋疫苗研究的一个关键环节。
目前用于防龋疫苗研究的载体菌主要是减毒的沙门杆菌和乳链球菌。
减毒的沙门杆菌能在体内、体外稳定地表达高水平的克隆基因，且重组后仍保持其对肠相关淋巴组织（gALT）peyer斑的粘附与定殖特性，可以激发较强的局部粘膜免疫反应。
用载有茸毛链球菌spaA基因的0.5kb三个重复片段与另一1.2kb的片段连接，插入质粒pYA292并转化减毒的沙门杆菌，将获得的重组沙门杆菌免疫大鼠，测得实验组血清抗spaAIgG和唾液抗spaAIgA水平明显升高，并导致茸毛链球菌介导的鼠龋齿发生率明显下降。
乳链球菌长期用于生产酸奶和奶酪等乳制品，其安全性已广为接受。
用乳链球菌作为载体构建的重组体，既具有克隆基因的免疫原性，又对机体安全无害。
iwaki等（1990）通过将变链菌pac基因连接到穿梭质粒pSa3上转化乳链球菌，构建携带pac基因的重组乳链球菌，经小鼠灌胃免疫，可诱导小鼠唾液特异性抗pScIgA及血清igG抗体产生。
我们（1997）将所构建的基因重组乳链球菌hL107经不同途径免疫孕兔，观察到孕兔唾液和乳汁中特异性抗pAc抗体的产生。
对定菌大白鼠行灌胃免疫发现，重组乳链球菌能有效刺激大鼠发生特异性免疫应答，防止龋病发生，进一步证明了重组乳链球菌的免疫防龋效能。
另外，运用基因工程手段将变链菌的两毒力因子pAc和gTF连接构建融合蛋白，也是前景看好的候选防龋疫苗。
yu等（1997）将pAc富含丙氨酸的唾液结合区（pAcA）分别与gTF—Ⅰ的葡聚糖结合区（gB）和蔗糖结合区（sB）融合，并在大肠杆菌表达。
利用重组融合蛋白pAcA—GB和pAcA—SB免疫兔，研究发现，兔抗pAcA—GBIgG能显著性抑制变链菌非水溶性葡聚糖合成，以及变链菌对唾液包被的hA的蔗糖依赖性和非蔗糖依赖性粘附；而抗pAcA—SB的抗体仅能抑制变链菌的非蔗糖依赖性粘附。
他们推测pAcA—GB融合蛋白在体内能明显抑制变链菌对牙面的粘附，具有广阔的应用前景。
5．核酸疫苗：近年来，一种新型的疫苗———核酸疫苗正成为世界瞩目的防止感染性疾病研究的热点。
它是将编码某种蛋白质的外源性基因（dNA或rNA）直接导入动物细胞内，诱导宿主对目的基因所表达的蛋白质免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。
它具有以下优点：①免疫原性强，表达的蛋白接近其天然构象；②可激发体液和细胞的免疫反应，免疫应答持久，且无毒力回升危险；③核酸疫苗具有共同的理化特性，为联合免疫提供可能；④疫苗制备简便，省时省力。