人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC3株超微结构的动态观察

【摘要】 目的 探讨蓝舌病毒靶向抗肿瘤的细胞生物学机制。方法 利用透射电镜观察蓝舌病毒HbC3株感染人肝癌细胞Hep3B的形态发生学以及该病毒引起的细胞的病理改变。结果 BTVHbC3以受体介导的胞饮作用穿入细胞，溶酶体水解病毒外衣壳，使之成为亚病毒粒子，胞浆内有病毒包涵体及未装配成熟的亚病毒颗粒。随后亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构，形成成熟的病毒粒子。病毒感染细胞12～18h时，细胞以挤出的方式释放病毒并达到高峰。18～48h时，病毒进入超感染期, 大量细胞发生病变, 出现细胞凋亡和溶解。结论 一旦蓝舌病毒感染Hep3B肿瘤细胞即可在细胞内增殖并诱导该肿瘤细胞进入凋亡，死亡的肿瘤细胞释放出的病毒粒子并再次感染其他肿瘤细胞，直至将全部肿瘤细胞杀灭，其溶瘤方式为链式反应。

【关键词】 蓝舌病毒HbC3（BTVHbC3） 人肝癌细胞（Hep3B） 形态发生学 溶癌病毒。

0 引言 　　癌的治疗问题至今尚未得到有效解决的重要原因之一是现有治疗手段缺乏靶向性。我们在长期的病毒与癌的研究过程中发现：不感染人正常细胞的蓝舌病毒HbC3株(Bluetongue VirusHb C3 strain,BTVHbC3)却能有效地杀死某些人和动物肿瘤[1,2]。BTVHbC3种生物学特性展示了其发展为靶向人癌病毒的潜能。本文以人类原发性肝癌细胞感染BTVHbC3为模型系统，进一步报导其相互作用后的超微结构变化，以初步探讨BTVHbC3靶向抗癌的细胞生物学机制。

1 材料与方法。

1.1 病毒与细胞 　　BTV HbC3株为本研究室于1994年湖北省分离的病毒株，人肝癌细胞Hep3B购自中国典型培养物保藏中心。Vero细胞为本室保存的BTVHbC3敏感增殖细胞株。Vero 细胞用于BTVHbC3的培养增殖和病毒效价测定；Hep3B细胞用于实验研究。

1.2 细胞培养、传代 　　Hep3B细胞采用含10％小牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5％ CO2条件下培养，常规法培养传代Hep3B细胞分别于25ml 10个培养瓶里。

1.3 BTV HbC3病毒增殖及病毒悬液制备 　　采用添加10％小牛血清的DMEM培养基培养Vero细胞，待细胞生长至80％～90％时，接种BTV HbC3悬液1ml于培养瓶，置37℃吸附1h后，弃培养液，以2％小牛血清的DMEM培养液继续培养。观察细胞病变效应（CPE）达到90％时收获细胞，反复冻溶3次，使细胞完全脱离；破碎、释出病毒；4 000r/min离心15min，收集上清。按本研究室常规方法[1]进行病毒TCID50滴定，病毒效价为105 TCID50/ml。然后按每试管1ml病毒悬液分装于10个试管，－80℃冻存备用。

1.4 BTV HbC3感染Hep3B细胞的样品制备 　　按每25ml培养瓶接种0.1ml病毒悬液（104TCID50）于10瓶Hep3B细胞，吸附细胞lh后，弃病毒液，洗细胞2次，然后加入含2％小牛血清的DMEM培养基维持培养。根据病毒感染细胞病变的特性，分别在不同10个时间段：2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、32h、40h、48h收获细胞。所有收获细胞用PBS洗2遍，EDTA消化，1 500r/min离心10min，弃上清，加2.5％戊二醛室温固定lh后，送电镜室制片。

1.5 电镜超薄切片的制备及电镜观察 　　将所固定样品，用0.1mol／L二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.4)在4℃下漂洗细胞2次，1％四氧化锇固定1h，梯度酒精脱水，Epon812包埋，LKB—V型超薄切片机切片，常规醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色。日立H－600透射电镜观察。

2 结果　　　　2.1 BTVHbC3感染Hep3B细胞超微结构的动态观察 　　BTVHbC3感染细胞2～4h时段， BTV吸附在细胞膜表面， 细胞膜逐渐包裹、 内陷， 以胞饮囊泡吞入方式进入细胞浆, 随之在溶酶体的酸性环境下脱去外衣壳， 将含病毒内衣壳和基因组的亚病毒核壳释放到细胞基质中（见图1）。 6～8h时， 胞浆内可见脱去部分外层衣壳的不完整病毒颗粒， 即亚病毒颗粒和病毒包涵体的形成（见图2）。 8～12h时， 病毒晚期蛋白合成， 主要是装配病毒颗粒的蛋白质、 酶和非结构蛋白。 胞浆内大量亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构， 逐渐形成成熟的病毒粒子。 12～18h时， 病毒包含体裂解和子代病毒的释放达到高峰。 病毒释放通过内质网以出芽方式形成小泡， 转运高尔基复合体送出细胞外。 18～32h时， 胞浆内可见大量病毒增殖并伴随病毒包涵体裂解， 释放出感染性的子代病毒颗粒及病毒核物质。 释放的子代病毒感染新的宿主细胞， 新一轮复制周期开始， 病毒进入超感染期。 32～48h时， 大量细胞病变和凋亡、 胞质内均富含不同发育阶段的病毒颗粒， 完整病毒颗粒、 病毒空衣壳和核物质， 细胞溶解和病毒彻底释放（见图3、4）。 凋亡细胞核膜结构完整， 核内染色质浓缩、 成块、 边聚， 细胞浆中有增殖的病毒颗粒， 内质网明显扩展并形成空泡， 线粒体肿胀， 为典型凋亡特征。