兔抗Cap43多克隆抗体制备和初步纯化

【摘要】 目的 制备兔抗Cap43多克隆抗体。方法 以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白(mcKLH)通过碳化二亚胺(EDC)法化学偶联成完全抗原(多肽—mcKLH)免疫家兔；制备兔抗Cap4443多克隆抗体；斑点ELISA法检测抗体效价，经辛酸—硫酸铵法初步纯化抗体后，十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度。结果 经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体，抗体效价为1：500。结论 采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH，使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原，用其免疫家兔获得多克隆抗体。

【关键词】 半抗原。

流行病学和动物实验已证实，镍化合物可以致癌，以致肺癌为主。为进一步研究Cap43在镍所特异引起肺癌者体内组织及血清中的表达水平及其特点，本实验采用硫化二亚胺(EDC)连接多肽与大分子载体蛋白的方法，使其组成完全抗原，进而免家兔制备抗Cap43多克隆抗体，为研究镍所致肺癌提供依据。

1 材料与方法。

11 材料 多肽由上海生工全自动合成仪合成；EDC试剂盒(美国Pierce公司)，完全及不完全福氏佐剂(美国Sigma公司)；HRP—羊抗兔和 DAB (北京中杉金桥生物技术公司)；硝纤维素膜(NC膜)，SephadexTMG—25 脱盐柱(Amersham Biosciences,Sweden),小牛血清，牛血清白蛋白(洛阳华美公司)；loading buffer(北京碧云天生物公司)；其他试均为国产分析纯；日本大耳兔平均体重15kg(本校动物实验中心)。

12 方法。

121 Cap43特征性肽段的合成 由上海生工合成Cap43 C末端特征性的由10个氨基酸(TRSRSHTSEG)重复3次所组成的肽段。总质量为10mg，合成后期经HPLC纯化，纯度95%。冷冻干燥4℃保存。

122 免疫大耳白兔制备抗Cap43抗血清 (1)正式实验之前的动物准备：取5只体重1.5kg的雄性家兔作为免疫动物，同时抽取免疫前的动物血清作为阴性对照。(2)用EDC法将半抗原与载体蛋白(mcKLH)连接成同时具有免疫原性与免疫反应性的大分子量完全抗原，反应过程严格按照EDC试剂盒的说明书进行。(3)使用脱盐柱脱盐，纯化大分子载体蛋白—多肽连接物：分别用10个15ml的EP管依次收集10管流出液，紫外分光检测波长280nm处各管的吸光度(A)值，如果在280nm波长处有1个显著的吸收峰，表示连接成功。(4)将连接好的半抗原—载体蛋白混合物与等体积佐剂的混合，采用常规微量多次免疫法免疫家兔(抗原0.5mg/只)，第1次免疫使用完全福式佐剂，并于4周后进行第2次免疫(第2次及以后使用不完全福氏佐剂)，以后每2周免疫1次，于第5次免疫后1周采耳缘静脉血，间接斑点ELISA法检测抗体的效价，达到一定效价后直视下心脏采血收集血清。

123 斑点ELISA法检测抗Cap43多克隆抗体效价 取硝酸纤维素膜(NC膜)制成4cm×4cm的方格，浸入01mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中10min，室温干燥后，将卵清蛋白(OVA)—半抗原(连接方法与上述半抗原—mcKLH相同)PBS液每格1μl包被NC膜，室温静置1h；2%的牛血清白蛋白溶液封闭，室温振荡1h；0.5%Tween20的PBS液洗3次，室温干燥；加一抗，同时设立阴性对照即免疫前小兔的血清，其与一抗稀释度相同，空白对照即0.01mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，每格1μl,室温静置1h后用洗涤液洗3次，室温干燥；加酶标二抗每格1μl,室温静置0.5h后用洗涤液洗3次，5min/次，室温干燥；每格加入适量底物DAB显色液，避光显色5～10min，蒸馏水冲洗中止反应，目测观察〔1〕。

124 辛酸—硫酸铵法纯化抗体 取需纯化的血清用60mmol/L，pH4.0醋酸缓冲液稀释4倍(01mol/L的HCl调pH4.5)；于室温搅拌下在30min内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的血清体积加75μl,4℃静置2h，15000r/min离心30min,弃沉淀；上清滤纸过滤后加1/10体积的pH7.4，01mol/L PBS(用1mol/L的NaOH调pH至7.4)；在4℃冰浴下于30min内加入0277g/ml硫酸铵，使成45%饱和度，4℃静置过夜，12000r/min，离心30min，弃上清；沉淀溶于适量001mol/L、pH7.4的PBS中，用PD10柱过滤，收集流出液，无菌过滤分装，—20℃保存备用。

125 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)电泳考马斯蓝检测体抗体纯度 采用12%SDS—PAGE 电泳检测抗体纯度，将电泳完后的凝胶放于溶解了0.25g考马斯亮蓝R250的甲醇、水、冰乙酸组成的染色液中室温过夜，之后放于脱色液中脱色，直至凝胶底色脱为无色为止，观察染色条带。

2 结果。

21 半抗原—载体蛋白连结后的A值(图1) 从图1可见，峰值在4，5管，此时收集第4，5管即峰值所在管中的溶液。

图1 半抗原—载体蛋白连接实验后的A值（略）。

22 斑点ELISA结果观察。

221斑点ELISA实验条件的选择 (1)最适抗原和酶标二抗浓度的选择：测定结果为抗原为1：20，酶标二抗浓度为1：320；(2)最适室温选择：室温下1h的效果较4℃过夜效果要好；(3)最佳封闭条件：采用2%牛血清白蛋白001mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液闭效果较好；(4)振荡对反应的影响：振荡可加快抗原抗体反应速度，与在振荡条件下封闭0.5h的效果相同；(5)血清灭活：阴性血清经灭活56℃灭活补体后假阳性反应减少。