返魂草中硒多糖及硒元素含量的测定
【摘要】 目的测定返魂草中硒多糖含量。方法采用回流提取法和微波超声波协同提取法提取样品中的硒多糖，利用正交实验确定微波超声波协同提取法的最佳提取条件；用硫酸—蒽酮法测定返魂草中硒多糖含量；用石墨炉原子吸收法测定硒多糖中微量元素硒。结果回流提取法提取得粗硒多糖含量为5.100%，回收率97.83%，精密度0.95%；微波超声波协同提取法提取得粗硒多糖含量为5.395%，回收率97.93%，精密度1.170%；石墨炉原子吸收法测得粗硒多糖中硒含量为24.4μg/g，回收率97.64%,精密度1.901%。结论微波超声波协同提取法提取的返魂草中硒多糖含量高于回流提取法提取的返魂草中硒多糖含量，因此，微波超声波协同提取法是一种快速、灵敏的提取方法。
麻叶千里光Senecio cannabifolius Lessl.又名宽叶返魂草, 为菊科千里光属多年生草本植物,主要分布于我国东北、河北等地及朝鲜、日本、前苏联远东地区, 生长于山沟林缘及湿草甸上, 该植物具有散瘀、止血、止痛的功效［1］, 在民间被广泛用于感冒、炎症的治疗。千里光属植物含有吡咯里西啶类生物碱, 该类生物碱的体内代谢物具有肝、肾损害等毒性作用, 已被英国、澳大利亚等国以安全性问题为由禁止使用, 使该属药材及其制剂的生产、销售和使用面临非常不利的局面。因此, 对千里光属药材进行系统的化学成分、药效和安全性评价十分必要［2］。 近年来,由于多糖大量的生物活性功能以及在功能食品和临床上的广泛使用,使多糖生物资源的开发和利用研究日益活跃,成为天然药物、生物化学、生命科学领域的研究热点。到目前为止,已有三百多种多糖类化合物从天然产物中被分离出,其中从植物,尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要,研究也十分活跃。 由于硒多糖在生物体内的含量甚少,因此国内外对硒多糖的存在形态及硒多糖中痕量硒的分析报道非常有限。生物体中微量的硒多糖以及硒多糖中超微量的硒限制了人们对硒多糖的深入研究,只有超高灵敏度的检测技术才有可能满足分析硒多糖中痕量硒的要求。本文采用蒽酮—硫酸法测定返魂草中硒多糖的含量，用石墨炉原子吸收法测定硒多糖中的硒含量。
1 仪器与试剂。
1.1 材料与试剂返魂草产自延边地区。乙醇、丙酮、乙醚、硫酸、蒽酮均为分析纯。硒标准储备液均为国家标准溶液（NCS），实验用水均为二次蒸馏水及娃哈哈纯净水。
1.2 仪器及工作条件FZ102型微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；数显式电热恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司) ；FA2104N电子天平(上海精密科学仪器公司)；CW—2000型微波超声波协同萃取仪（上海新拓微波溶样测试技术有限公司）；TAS—990型原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。石墨炉原子吸收仪器的工作条件见表1～2。 实验所用玻璃仪器均经稀硝酸浸泡12 h以上，然后经自来水、蒸馏水、去离子水依次洗净烘干备用。
2 方法与结果。
2.1 样品处理用蒸馏水反复冲洗返魂草，于60 ℃恒温箱中干燥，然后用微型植物粉碎机粉碎装瓶备用。
2.2.1 回流提取法称取返魂草全草用30～100目粉碎机粉碎，称取10.0 g置圆底烧瓶中，加入乙醚200 ml，回流提取70 min，然后抽滤，弃去滤液，将滤渣小心转移至烧瓶内，用乙醚冲净滤纸上的滤渣一起转移至圆底烧瓶内，再加入乙醚200 ml，回流提取60 min，同样方法进行抽滤转移，再用150 ml乙醚回流提取60 min，使滤液基本无色。将滤渣风干除去其中乙醚，转移至干净的圆底烧瓶中，用200 ml去离子水沸水回流3次，30 min/次，趁热过滤，合并滤液，将滤液至电炉上浓缩至50 ml，加入无水乙醇200 ml，使醇含量为80%。静置过夜，滤过。沉淀再加水溶解，加乙醇至醇含量为80%静置过夜，取沉淀分别用无水乙醇、丙酮依次洗涤3次，20 ml/次，置45 ℃烘干后可得棕色粗多糖0.51 g。表1 TAS—990型石墨炉原子吸收分光光度计工作条件（略）表2 TAS—990石墨炉的硒元素测定加温程序（略）。
2.2.2 微波超声波协同提取法精确称量返魂草样品6份各10.00 g，根据单因素实验和正交实验得出的最佳条件，在最佳优化方案下即料液比为1∶35，提取功率为250 W,提取时间为180 s条件下提取，按照“2.2.1”项方法进行平行测定6次，得到10.00 g返魂草中粗多糖提取率分别为5.41%，5.56%，5.33%，5.28%，5.34%，5.45%，粗多糖平均提取率5.395%。
2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制将一定量葡萄糖标准品粉末于107 ℃烘干至恒重，精确称取葡萄糖标准品粉末0.020 g于100 ml容量瓶中，定容、摇匀。精确量取葡萄糖标准品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml,分别置10 ml量瓶中,纯化水定容,摇匀,再分别精密量取2.0 ml,置干燥具塞试管中,加入蒽酮—硫酸试剂4.0 ml,立刻摇匀,冷却至室温置于暗处。同时以2.0 ml去离子水,加蒽酮—硫酸试剂4.0 ml作空白。在620 nm波长处测定吸收度。以葡萄糖含量（μg/ml）为横坐标,吸光度(A)为纵坐标进行回归,得回归方程为：Y = 0.007 2X+ 0.008 7,R2=0.998 5。
2.3.2 粗硒多糖溶液的制备及纯度测定精确量取粗硒多糖0.030 g，加入去离子水溶解，转移至100 ml容量瓶中。精密量取配好溶液1.0，2.0，3.0 ml各3份,置干燥具塞试管中,各加蒽酮——硫酸试剂4.0 ml,立即摇匀,冷却至室温,按“2.3.1”项下操作。 粗硒多糖纯度按下式计算： 粗硒多糖纯度（%）=(A—0.0087)×100/0.0072×VW×106 (A:吸光度；W:量取粗硒多糖质量；V:取液量) 根据三组数据0.351,0.698,1.040计算得粗硒多糖平均纯度为15.9%，由返魂草中粗硒多糖平均提取率为5.395%(“2.2.2”所得),所以返魂草中硒多糖含量为5.395%×15.9%=0.86%。
2.4 加样回收率实验精密量取粗硒多糖溶液1.0,2.0,3.0 ml,分别加入葡萄糖标准品溶液1.0,2.0,3.0 ml置10 ml量瓶中,再分别量取4.0 ml蒽酮—硫酸试剂置干燥具塞试管中在620 nm 波长处测定吸收度。结果见表3。表3 回收率实验结果（略）。
2.5 精密度实验分别精密取同一供试液5 份,每份2.0 ml,置干燥具塞试管中,各加蒽酮—硫酸试剂4.0 ml,立即摇匀,冷却至室温, 按“2.3.1”项下操作,计算精密度。结果RSD为0.95%和1.17%。表4 精密度实验（略）。