山羊黑素皮质素受体—3基因转录水平差异分析
引言 【研究意义】黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊和黔北麻羊是贵州省的优良山羊品种，南江黄羊是四川南江县选育而成的肉用型山羊品种，这5个山羊品种对重峦叠嶂、山高谷深、沟壑纵横的贵州高原山地有很好的适应性，可常年放牧，且育肥性能好，繁殖力强，肉质优良，是贵州存栏量较大的山羊品种。研究其生长及肉质性状的相关基因，对于发展贵州羊肉产业具有重要意义。【前人研究进展】黑皮质素受体（Melanocortin receptor，MCR）基因家族有5个成员，MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R。其中，MC3R是由单一外显子编码的包含323个氨基酸残基的一种跨膜G蛋白耦联受体，是MCR中最晚被克隆和鉴定的一个，具有降低摄食频率控制采食行为、增加能量消耗调节能量平衡、减少脂肪贮量调节体重的功能（Singh et al.，2013；Okutsu et al.，2015；Yang et al.，2015），因此，MC3R基因常作为体重标记的候选基因。苏毅（2006）研究发现鸡MC3R基因1424 SNP位点与屠宰前体重和屠体重、胸肌重、腿肌重及腹脂重显著相关；王彦等（2007）研究发现鸡MC3R基因A1424G突变与屠体性状、腹脂重、皮下脂肪显著相关；李世鹏等（2008）研究发现石岐肉鸽MC3R基因T91G突变与活重、屠体重、全净膛重显著相关；杜鹏等（2010）研究发现比格犬MC3R基因T167A碱基置换对犬体重有显著影响；张轶博和巴彩凤（2013）研究发现北方实验用犬MC3R基因A167T位点突变与其体重、胸围和体重指数等显著相关；薛倩等（2015）从京海黄鸡的MC3R基因编码区序列检测到6个SNP位点，得到5种单倍型和11种单倍型组合，不同单倍型组合间京海黄鸡屠体性状（包括活体重、屠体重、胸肌重、腿肌重、全净膛重、半净膛重和腹脂重）存在显著或极显著差异；张心扬等（2015）在肉鸡高、低脂双向选择品系的研究中发现MC3R基因C273T突变对第六世代和第八世代两个群体的7周龄体重和屠体重有显著本文由收集整理影响。【本研究切入点】目前国内外关于山羊生长和肉质相关基因的研究较多，但鲜见MC3R基因在不同山羊品种及其不同组织中转录水平的研究报道。【拟解决的关键问题】采用双标准曲线和Taqman实时荧光定量PCR对黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊5个山羊品种的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌和皮下脂肪中MC3R基因转录水平进行检测，并分析MC3R基因在不同品种及组织间的表达差异，为深入研究山羊MC3R的作用部位、特点及功能提供理论参考。 1 材料与方法 1. 1 试验材料 黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊、南江黄羊的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪等组织采自贵州省雷山县和榕江县。每个品种4只，雌雄各2只，年龄5～7月龄，体重14～17 kg/只。总RNA提取试剂Trizol购自上海英骏（Invitrogen）生物技术有限公司，标准品PCR试剂盒GeneSolution 2Taq Master Mix购自上海硕盟生物科技有限公司，胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，逆转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit和实时荧光定量PCR试剂盒Realtime PCR Master Mix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。主要仪器设备：H1650—W台式微量高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），Eppendorf Centrifuge 5415D离心机（德国Eppendorf公司），Ultra Pure UF除热源型超纯水机（上海和泰仪器有限公司），FTC—3000实时荧光定量PCR系统（加拿大Funglyn Biotech公司），Eppendorf Research Plus移液器（德国Eppendorf公司），Mini Centrifuge八联管离心机（Eppendorf公司），BIO—RAD Powerpac Basic电泳仪系统（BIO—RAD公司）。 1. 2 引物及探针 根据NCBI公布的山羊MC3R基因序列（XM_ 005688325.1）及—actin基因序列（XM_005694067.1）設计标准品引物、定量引物及TaqMan探针（表1），并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其中，探针的5‘端标记FAM基团，3‘端标记TAMRA基团。 1. 3 总RNA提取及cDNA合成 用Invitrogen Trizol RNA提取试剂盒提取各组织样品的总RNA，再用ReverTra Ace qPCR RT Kit逆转录试剂盒制备cDNA。逆转录过程：0.1～2.0 g总RNA加RNase—free ddH2O至14.0 L，混匀，65 ℃变性5 min，冷却。再加5RT Buffer 4.0 L，Enzyme Mix 1.0 L，RT Primer 1.0 L，混匀，42 ℃逆转录18 min，然后98 ℃灭活5 min，—20 ℃保存备用。