猕猴桃采后致病菌的分离及中草药提取物对其抑菌效果初探
猕猴桃是深受消费者和果农喜爱的水果。采收期在9—10月，很多地方正值气温较高的季节，加之猕猴桃是呼吸跃变型果实，在常温下极易软化和腐烂变质。猕猴桃不耐贮藏很大程度上是因为贮藏期间有青绿霉或者软腐病状的病菌侵入引起了各种病害及腐烂。因此采收后应尽快放在适宜的贮藏条件下，并采取有效的防腐保鲜措施。 随着湖南省猕猴桃产量的不断增加，猕猴桃的贮藏将成为一个迫切需要解决的难题。为了让消费者吃到安全而又卫生的水果，各个国家的科学家都在致力于寻找一种新的保鲜技术、一种能够代替化学药物的保鲜产品。同时，非化学性的杀菌剂用来控制果实采后的病害将成为以后长时间的研究热点并形成一个发展方向。很多研究发现，植物的粗提物和它的挥发油等用于控制果蔬采后致病菌具有非常好的效果。 1 材料与方法 1.1 供试材料 猕猴桃病果来源于湖南省本文由收集整理猕猴桃主产区及湖南省园艺研究所白有冷库；新鲜果实于湖南省园艺研究所果园摘取。 1.2 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的配制 取200g清洗干净并去皮的马铃薯，切成2cm的小块，放入干净的锅巾，煮沸30min，用纱布过滤至三角瓶中，随后加入20g葡萄糖和20g琼脂，待其充分融化后，加水至1000mL，121℃高压灭菌20min，冷却后储存备用。 1.3 感病猕猴桃病原菌的分离 用试验专用刀将猕猴桃果实的感病组织切下，用接种针挑取放入70%的酒精巾浸泡30s左右，迅速放人1%的次氯酸钠溶液巾浸泡lmin，随后用无菌水清洗2—3次，放入倒好PDA培养基的平板中，置于28℃培养箱黑暗培养3d左右。分离纯化3次获得纯化菌种后移入试管中，放入4℃冰箱保存备用。 1.4 病原菌的回接验证及分析鉴定 取分离到的病原菌，采取有伤接种的方式，将其接种到表面干净并消过毒的健康果实上。接种过的果实放置于带有加湿功能的培养箱中常温培养。如果重新接种后果实发病的病状与贮藏时病果的症状相符合，随后从发病的果实上再次分离得到病原菌。参照魏景超的《真菌鉴定手册》做进一步的鉴定。 1.5 病原菌致病性试验 将长势良好的适龄PDA培养基平板上的菌落用灭过菌的打孔器打出直径为4mm的菌饼，留以备用。将新鲜的猕猴桃果实表面消毒后，采用刺伤接种的方式，将打好的菌饼菌丝面紧贴在果实表面上。放入清洗干净的瓷盘中进行保湿，随后置于培养箱中常温培养。 定期观察接种后果实发病的情况并测量病斑的直径，根据发病果实的病斑大小判断该病菌致病性的强弱。无致病性的将其记为—，有致病性的记为+，致病性的强弱分别采用1、2、3、4个+表示，划分该强弱的标准分别为病斑直径x5mm、5mmx10mm、10mmx15mm、15mmx20mm。病菌的菌斑直径采用米字形来测量3次重复后求平均数。未接种病菌的新鲜果实作为对照。 br="" 1.6 中草药提取物对病原真菌的抑制作用 采用生长速率法，将巾草药提取液和PDA培养基混合均匀制成带药培养基，随后倒入9cm的培养皿巾，冷却。在平板培养皿巾央接种直径为4mm的病菌菌饼。早期筛选发现.当巾草药提取液浓度为8.25mg/mL时，抑菌效果最好。以相同量的无菌水代替药液作为对照，提取物对类似青霉病原菌的抑菌效果采用改良的生长速率法。 菌落直径采用十字交叉法，测量3次重复求平均数；根据菌落直径计算菌丝生长相对抑制率（%）=（对照的菌落直径一处理的菌落直径）/对照的菌落直径lOO。 2 结果与分析 2.1 病原菌分析 根据常规组织分离法从采集回的猕猴桃发病果实内分离出9株致病真菌，其命名如表1所示，将他们置于PDA培养基、28℃培养箱巾培养，观察其形态发现，青I—I，青4—1—1，青4—1—2，青4—2，青9—2，青11—2，青12—4菌落形态特征一致。绿1和灰1分别为特异性状致病菌。 2.1.1 青霉菌的菌落形态 菌落的颜色呈现出暗青色，粉粒状，生长速度较快，边缘呈白色。从背面观察培养基，发现基质由浅黄色慢慢变为黄褐色，并随着培养时间的延长而逐渐加深。镜检观察分生孢子梗无色，一端具1—3个分枝，扫帚状；分生孢子呈念珠状串生，单孢无色，近球形；该菌株在果皮及内部形成，开始为水渍状，边缘不明显，之后长出菌丝，慢慢形成青色霉层，深褐色水渍斑扩展，有较重霉味。综合特征及其引起的症状，将病菌命名为青霉菌。 2.1.2 黄腐病菌的菌落形态菌落直径生长至9cm，覆盖住整个培养皿。培养初期，菌落生长为白色，气生菌丝稀疏，呈绒毛状，后来慢慢变为绿色。在培养基的表面和培养基底部会形成黑色的颗粒状物，为分生孢子器。分生孢子在显微镜下观察为无色，单胞，椭网形。综合上述特征及其引起的病状，将此病拟命名为黄腐病。 2.1.3 交链孢霉菌的菌落形态菌落生长速度较快，菌落呈绒毛状，其颜色多为灰黑色至黑色。菌落巾央为灰色，菌丝暗至黑色，有隔膜，有分生孢子。在显微镜下观察到分生孢子倒棒状，其颜色为淡褐色，有分隔，孢子的形态及大小不规律，根据其引起的病状特征同时参阅相关文献将此病菌命名为交链孢霉菌。 2.2 致病性验证 将新鲜的猕猴桃果实表面消毒后，采用刺伤接种的方式，将分离到的病原菌接种在猕猴桃果实表面，致病性结果见表1。由表1可知，在刺伤条件下，9个分离得到的病原菌均能使猕猴桃果实致病。其中致病性最强的为青11—2，致病性达到了++++；致病性最弱的为青1—1，致病性仅为++。对接种后发病的果实病斑进行再分离，又得到与纯化后病菌性状一致的病原菌。 2.3 中草药提取物对致病菌的离体抑制效果 参照陈年春的生长速率法，选取3株有独特性状且具有较强致病性的致病菌，通过带毒培养基试验进行初步筛选，发现川芎和高良姜提取物对3种致病菌有较好的抑制作用。由表2可知，川芎提取物对致病菌绿1、灰1、青4—1的菌丝生长相对抑制率分别达到82.56%、88.40%、94.l9%；高良姜提取物对致病菌绿1、灰1、青4—1的菌丝生长相对抑制率分别达到71.51%、60.87%、79.07%. 3 结论与讨论 以猕猴桃为研究对象，针对猕猴桃采后贮藏期间真菌危害致腐而长期无法突破的难题开展研究。研究将巾草药提取物川芎和高良姜用于猕猴桃贮藏期间常见低温病害软腐病和青绿霉菌病，对突破猕猴桃贮藏保鲜技术瓶颈具有重要意义。项目研究结果如加以纯化利用可直接用于生产具有巾草药活性成分的保鲜纸和保鲜袋，可将其用于猕猴桃生产上的贮藏保鲜。