微柱凝胶免疫分析技术在血小板抗体筛选中的应用
作者：许德义 董国飞 张哲 彭明喜 杜勇 陈长水 汤晓娴 付荆艳 高家良 白洁 马幼丽 钱伯勇 马建波。
【摘要】 为了探讨微柱凝胶免疫分析技术在血小板输注中血小板抗体筛选和配型的临床应用价值，运用微柱凝胶免疫分析技术检测血小板抗原抗体反应,包括抗体筛检、交叉配血。结果显示： 30例再生障碍性贫血（AA）、11例骨髓增生异常综合征（MDS）和25例白血病患者中24例血小板抗体的检测均为阳性，20例其他病例中有1例血小板抗体检测阳性（占5%），20例正常献血员的血小板抗体检测均为阴性。多次输注血小板的112个AA血液标本、42个MDS血液标本和95个白血病血液标本的血小板抗体交叉相合数分别为45、20和40个，相合率分别为40.18%、47.62%和42.11%； 20例多次输注血小板的病人交叉配合前的血小板增高指数(CCI)平均为4.7，交叉配合后为18.2。结论：恶性血液病患者中血小板抗体筛检的阳性率很高；249个血液标本的血小板交叉配型的相合率在40%—48%之间；交叉配型后的血小板临床使用效果明显提高。
Application of Microcolumn Gel Immunoassay in Screening the Platelet Antibody。
Abstract The purpose of this study was to explore the clinical value of the platelet antibody screening and typing in platelets transfusion by using microcolumn gel immunoassay (MGIA). The platelets antigenantibody reactions including the antibody screen and blood crossmatch were detected by MGIA. The results indicated that the detection of platelet antibody showed positive in 30 cases of aplastic anemia (AA), 11 cases of myelodysplastic syndrome (MDS), 24 out of 25 cases of leukemia and 1 out of cases of other diseases, while detection of platelet antibody showed negative in 20 normal volunteer donors. The number of platelet antibody crossmatch coincidence in 112 specimens of AA, 42 specimens of MDS and 95 specimens of leukemia were 45, 20 and 40, the coincidence rates were 40.18%、47.62% and 42.11% .The mean corrected count increment (CCI) in 20 patients received platelet transfusion many times was 18.2 after crossmatch and 4.7 before crossmatch. It is concluded that the positive rate of platelet antibody screening is very high in patients with hematologic malignancies, the coincidence rate of platelet antibody crossmatch in 249 blood samples is between 40% and 48%, and the effeciency of using crossmatched platelets in clinic is enhanced significantly.
Key words platelet antibody screening; platelet typing; microcolumn gel immunoassay。
近年来，随着临床输血事业的发展、成分输血的推广，各种血液成分的应用也正在发生变化, 血小板（Plt）的使用日益广泛。然而，病人经多次输注血小板后，会产生各种抗体，容易造成血小板输注无效，因此有必要建立血小板抗体筛选配型技术。现在，临床上如血小板生成障碍、血小板功能异常、稀释性血小板减少的病人均需提供血小板，然而多次输注后， 由于免疫因素或其他因素使输入的血小板破坏，输注效果不佳或完全无效，因而成为临床医生的难题。究其原因——血小板输注无效主要是免疫性破坏，这是当前输血领域内所关注的焦点之一。引起免疫性血小板输注无效的原因首先是HLA抗原不合，其次是血小板特异抗原的抗体，常见的有抗HPA2b等。现在常用的抗体检测方法有血小板单克隆特异性抗体固定试验（MAIPA）、微柱凝胶试验（MGT）、简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA）等。
微柱凝胶免疫分析技术在血小板抗体筛选中的应用大部分免疫性血小板减少性紫癜患者血小板膜上可测出血小板相关抗体（PA ），包括IgG、PA IgM、PA IgA，其中一项出现阳性，即为血小板抗体检测阳性，而且其量往往与外周血的血小板数量呈负相关，因此检测这种血小板相关抗体有助于免疫性血小板减少性紫癜的诊断［1］。
目前，在宁波市各大医院的临床工作中很需要开展血小板配型的研究，为此我们建立了血小板配型技术，用微柱凝胶方法进行血小板交叉配合试验选择供者，即选择供者血小板与受者血清中已产生的抗体不发生抗原抗体反应的供者。该项目的开展解决了临床上血小板输注无效的难题，提高了临床血小板输注疗效，具有重要的临床意义。
材料和方法。
病例。
66例血液病患者（包括AA 30例，MDS 11例，白血病25例），其他病例20例，正常献血员20例。检验标本均来自于2004年10月至2006年8月期间宁波市各大医院的病人及随机抽取的来我站献血的正常献血员。
仪器。
SORVALL Biofuge pico 离心机、BYL型血型血清学多用离心机（BYFI型，长春博研科学仪器有限公司）、免疫微柱孵育器。
试剂。
试剂由中国吉林省长春博迅生物技术责任有限公司提供，试剂盒由微柱凝胶抗人球蛋白试剂卡、指示红细胞、红细胞保存液、对照血清(血小板抗体阴性血清、血小板抗体阳性血清)、裂解血小板、稀释液组成。
微柱凝胶卡18—25℃避光保存，配置试剂4—8℃避光保存。所有试剂及凝胶卡使用前应达到室温(不低于20℃)，如果温度过低(低于18℃)，则凝胶卡应放在37℃条件下孵育30分钟。
抗体筛选。
血浆标本制备 应用含促凝剂的试管。采集被检对象静脉血2—5毫升，轻轻摇动混匀2分钟， 1 000—1 200×g离心5分钟，取上清。
血清标本制备 采集被检对象静脉血，放入无抗凝试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后1 000—1 200×g离心10分钟，取上清（该上清不得有絮状物沉淀）。
指示红细胞制备 冻干指示红细胞现配现用，用1 ml生理盐水溶解后，再用生理盐水洗涤3次（1 000—1 200×g离心1分钟），最后用1 ml红细胞保存液配置指标红细胞，溶解后的冻干指示红细胞最好当日用完，若需保存，可在4℃条件下，保存2周，但在使用前必须做空白对照实验（仅将指示红细胞加入微柱凝胶卡中）离心结果为阴性方可继续使用。
检测步骤 ①取微柱凝胶抗人球蛋白试验卡，标记1、2、3、4、N、P（1、2、3、4指受检标本、N指阴性对照、P指阳性对照）。②将标记1、2、3、4孔依次加入受检者血清、稀释液、裂解血小板、指示红细胞各50 μl；将标记N孔依次加入阴性血清、稀释液、裂解血小板、指示红细胞各50 μl；将标记P孔依次加入阳性血清、稀释液、裂解血小板、指示红细胞各50 μl。③将已加样的微柱凝胶卡37℃孵育15分钟。④即刻使用专用离心机1 000×g离心2分钟，1 600×g离心3分钟，然后取出肉眼观察结果。