柴胡皂苷—d对乙醇损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用及其机制研究

作者：李素婷 姜凌雪 周晓慧 杨鹤梅。

【摘要】 目的研究柴胡皂苷—d（SS—d）对乙醇损伤大鼠原代培养肝细胞保护的作用和机制。方法采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SS—d对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）的活性，MTT法检测肝细胞存活率。结果SS—d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量升高和GSH—px活性降低均有明显的抑制作用。结论SS—d对乙醇损伤大鼠肝细胞有保护作用，其机制可能与SS—d清除自由基、抑制质脂过氧化作用有关。

【关键词】 乙醇 肝细胞 原代培养 柴胡皂苷—d 保护作用 机制。

随着人们生活水平的提高和饮酒量的增加，酒精对肝脏的损害日渐突出。了解酒精对肝损伤的机制，筛选有效预防和治疗酒精性肝损伤的药物应用于临床，是亟待解决的重要课题。目前，中药复方对酒精性肝损伤的实验研究和报道比较多，单味制剂报道较少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中药柴胡的有效成分，根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS—d)药理活性作用最强。整体水平研究表明柴胡皂苷对酒精性肝损伤有预防作用［1］。本文建立体外乙醇损伤肝细胞模型，在细胞水平上进一步研究柴胡有效成分SS—d对乙醇损伤肝细胞的保护作用机制。

1 器材与方法。

1.1 药品与试剂 SS—d（纯度98%），昆明长春花科技有限公司提供，临用前以蒸馏水配制；Hanks液高压灭菌,4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，—30℃保存；基础培养液，RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，链霉素100 μg·ml－1，胰岛素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH—px测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 动物 SD大鼠，2～4 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。

1.3 仪器 CO2培养箱（Taibai LNA—122D 日本），MD—100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。

1.4 肝细胞分离培养［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后断头放血，无菌分离肝脏，去除肝脏外膜及其周围结缔组织，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml,37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1 000 r离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数85%，按1 ×109个·L—1接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养24 h后更换培养液去除血细胞，继续培养72 h后进行分组实验。

1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板，设正常对照组及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14个剂量组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，MTT法测定肝细胞存活率。

1．6 MTT法选择SS—d的实验浓度 SS—d初浓度为5 mg/L，采用细胞培养液进行稀释，依次为5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。将肝细胞接种于96孔板培养72 h更换培养液，换用SS—d稀释液培养，另设空白对照组，12 h后吸出培养液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亚砜200 μl，混匀以溶解被还原的MTT结晶，检测波长为492 nm的光密度值，计算药物不同稀释浓度下细胞的存活率。

1.7 SS—d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SS—d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SS—d组加入乙醇100 mmol·L－1，同时SS—d组加入不同浓度的SS—d，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞检测MDA含量和GSH—px的活性，MTT法测定肝细胞的存活率。

1.8 统计学处理 数据以 表示，用SPSS计算机软件进行统计学分析, 组间比较采用t检验，P0.05有统计学意义。

2 结果。

2.1 乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol·L－1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明显，我们选择乙醇浓度为100 mmol ·L－1制备肝细胞损伤模型。见表1。表1 不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响 与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6。

2.2 SS—d 实验浓度的选择SS—d不同浓度时细胞存活率见表2，为避免药物浓度过大所致的细胞毒性作用，应选择对细胞生长无明显影响即肝细胞存活率在90%以上的浓度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L—1)作为实验所用药物浓度。见表2。表2 不同浓度SS—d对肝细胞存活率的影响与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6。