香烟烟雾提取物对气道上皮细胞增殖和FIP200表达的影响
Effect of cigarette smoke extract on proliferation and cycle of human airway epithelial cell and its FIP200 expression。
【Abstract】 AIM: To study the effect of cigarette smoke extract （CSE ） on the proliferation and cycle of human airway epithelial cell and its mechanism. METHODS: After airway epithelial cells were treated with CSE, the proliferation was measured with MTT and the distribution of different cell cycles was detected with flow cytometry. FAKfamily interacting protein of Mr 200 000 (FIP200) mRNA expression level, FAKfamily interacting protein of Mr 200 000（FIP200）expression level and the association of FIP200 with focal adhesion kinase（FAK）were analyzed respectively by reverse transcriptionpolymerase chain reaction（RTPCR）, Western blot and immunoprecipitation. RESULTS: CSE inhibited the proliferation of human airway epithelial cells and arrested the epithelial cells in G1 phase of cell cycle. The number of epithelial cells in S and G2 phase dramatically decreased （P0.01）. CSE increased the expression level of FIP200 mRNA and FIP200 and the association of FIP200 with FAK（P0.01）. The effects of CSE on airway epithelial cells were all in a doseandtime dependent manner. The expression of FIP200 mRNA and FIP200 and the association of FIP200 with FAK were positively correlated to the increased number of epithelial cells in G1 phase（P0.01） and negatively correlated to the proliferation and the number of epithelial cells in S and G2 phase（P0.01）. CONCLUSION: CSE can inhibit the proliferation of human epithelial cells and the increased expression of FIP200 may be one of the factors responsible for it.
【Keywords】 CSE; airway epithelial cell; cell proliferation; FIP200。
【摘要】 目的： 研究香烟烟雾提取物（CSE）对气道上皮细胞增殖和细胞周期的影响及其作用机制. 方法： 利用MTT法研究CSE对气道上皮细胞增殖的影响，采用流式细胞术分析气道上皮细胞细胞周期的影响，以RTPCR和Western blot检测气道上皮细胞FIP200 mRNA和蛋白表达，以免疫共沉淀检测FIP200与局灶粘着斑激酶（FAK）连接状况. 结果： CSE干预的气道上皮细胞MTT吸光度比对照组明显降低，G1期细胞增多，S和G2期细胞明显减少（P0.01），FIP200 mRNA, FIP200的表达水平以及FIP200与FAK的连接均显著增高（P0.01），且随CSE干预时间和CSE浓度而增大；气道上皮细胞FIP200表达水平和FIP200与FAK连接的增高均与G1期细胞增多呈正相关（P0.01），与S和G2期细胞减少呈负相关（P0.01）. 结论： CSE显著抑制气道上皮细胞的增殖，FIP200的高表达可能是其作用机制之一.
【关键词】 香烟烟雾提取物； 气道上皮细胞； 细胞增殖；FIP200。
0引言。
气道上皮是呼吸器官对抗有害刺激的第一道防线，上皮受损后的及时修复是维持气道稳态的重要环节. 支气管上皮细胞损伤脱落是哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）等呼吸道疾病的起始环节和病理基础，而气道疾病的缓解有赖于上皮完整性的修复与维持. 其修复包括细胞向损伤部位迁移，细胞增殖和细胞细胞、细胞细胞外基质黏附等中心环节［1，2］. 吸烟是呼吸道疾病的重要原因之一，它可能通过多种机制引起呼吸道疾病的发生发展. 已有很多实验证实由吸烟引起的炎症对气道疾病的重要性，但吸烟是否通过影响气道上皮细胞增殖从而影响其损伤修复尚未有报道，我们将以此为目的进行实验研究.
1材料和方法。
1.1材料。
按Akamura等［3］方法，将2支去过滤嘴香烟（红双喜牌，武汉卷烟厂生产）于一个注射器驱动装置连接抽吸而燃着，10 min燃完，吸入的烟雾经另一个出口通入50 mL无血清培养液中制成悬液. 悬液用1 mol/L NaOH调至pH 7.4，经0.22 μm微孔滤膜过滤备用. 制备的香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)在30 min之内用于实验. 人支气管上皮细胞系MBE由中国医学科学院肿瘤研究所程书钧院士惠赠, 用DMEM:F12无血清培养基培养，加入人重组表皮生长因子5 μg/L,胰岛素5 g/L,转铁蛋白10 g/L,氢化可的松0.2 mol/L,三碘甲状腺素0.65 g/L,肾上腺素0.5 g/L,牛垂体粗提物35 g/L,乙醇胺0.5 mol/L（均购自Gibco公司）,庆大霉素100 g/L,青霉素100 g/L,链霉素100 g/L，最后用NaHCO3滴定到pH 7.0. 细胞接种于覆盖有40 mg/L FN的培养板，37℃含50 mL/L CO2温箱培养，待细胞80%融合成片时，换用含CSE的培养液继续培养.
1.2方法。
96孔培养板接种细胞，培养干预后，每孔先后加5 g/L MTT液20 μL和DMSO 150 μL，用酶联免疫检测仪于波长490 nm处测定各孔吸光度；其中每个浓度或时间点重复3次实验，每次重复6个复孔. 制备单细胞悬液，预冷的无水乙醇固定，PBS漂洗，用4℃碘化丙啶染色30 min，取1×106个细胞在流式细胞仪上进行细胞周期分析. 采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法从细胞中提取总RNA为模板，按MBI公司RTPCR试剂盒说明书合成cDNA为模板，加入Taq酶和dNTP等进行PCR. FIP200引物由上海博亚公司合成：上游引物：5′TCAGGTGGGAGATTTG3′，下游引物：5′TCCATGATACGGCTTT3′，扩增片断大小269 bp；βactin上游引物：5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物：5′CTCCTTAATGTCACGCACGTATTC3′，扩增片断大小540 bp. 另用预冷的RIPA细胞裂解缓冲液0.25 mL裂解细胞，用改良的Lowry法进行蛋白定量. 取蛋白10 μg，进行SDSPAGE转膜，用1∶1000的抗FIP200多抗（Santa Cruz）进行杂交，二抗为1∶2000的辣根过氧化物标记的山羊兔抗IgG（中山公司），最后用增强的化学发光试剂显色（Santa Cruz）. 另取100 μg总蛋白，加入FIP200多抗（Santa Cruz），反应后加入50 μL A蛋白Sepharose珠进行沉淀，后行SDSPAGE转膜，用1∶1000的抗FAK多抗杂交，二抗为1∶2000的辣根过氧化物标记的山羊兔抗IgG（中山公司），最后用增强的化学发光试剂显色.统计学方法： 实验数据以x±s表示，MTT吸光度值多组间均数比较用双因素方差分析，其余多组间均数比较用单因素方差分析，当方差不齐时采用反正弦平方根变换为齐性后采用单因素方差分析，线性相关关系用直线相关分析，P0.05认为差异有统计学意义. 数据分析采用SAS软件计算.
2结果。
2.1CSE对气道上皮细胞增殖的影响气道上皮细胞经50，100和200 mL/L CSE干预6，12，24和36 h A值均降低（P0.01）；呈时间和浓度依赖性（P0.01, Fig 1）.
流式细胞分析（Tab 1, 2）中G2期数据方差不齐，均先采用反正弦平方根变换为方差齐性后再做单因素方差分析，发现100 mL/L CSE干预6，12，24和36 h G1期细胞数比对照组增高（P0.01），S期及G2期细胞数量明显减少(P0.01)，而且这些变化均随CSE浓度的增加而有增大的趋势（Tab 2）.表1100 mL/L CSE不同干预时间细胞周期各期细胞所占的百分比（略）表2不同浓度CSE干预24 h气道上皮细胞细胞周期各期所占的百分比（略）。