大鼠肾小球系膜细胞表型的增龄性变化

作者：卓莉 蔡广研 刘伏友 傅博。

【摘要】 目的 观察大鼠肾小球系膜细胞随增龄细胞表型及功能的变化特点。 方法 取3、12、24月龄健康雄性Wistar大鼠原代系膜细胞进行培养，MTT法检测细胞增殖能力，进行SAβgal染色，采用RTPCR和Western印迹法分别检测p21WAF1/CIP1/SDI1基因及蛋白质的表达变化，并用免疫荧光法检测系膜细胞中p21WAF1/CIP1/SDI1的表达与定位。 结果 大鼠肾小球系膜细胞增殖能力随增龄逐渐减弱(P0.05)，SAβgal染色阳性率随增龄逐渐增加(P0.05)，p21WAF1/CIP1/SDI1 mRNA及蛋白质表达随增龄逐渐增加(P0.05)。免疫荧光结果示p21WAF1/CIP1/SDI1主要在细胞核内表达，荧光强度随增龄逐渐增强 (P0.05)。 结论 大鼠肾小球系膜细胞随增龄细胞形态、增殖能力与衰老相关蛋白表达发生明显改变，出现了复制性衰老表型。

【关键词】 系膜细胞；衰老；细胞表型；p21WAF1/CIP1/SDI1。

【Abstract】 Objective To investigate the characteristic of rat mesangial cells with advancing age. Methods Male Wistar rats aged of 3, 12, 24 months were used. The rat mesangial cells were processed for MTT assay and senescence associated βgalactosidase (SAβgal) staining. The expression and location of p21WAF1/CIP1/SDI1 in mesangial cells were studied by immunofluorescence. The mRNA and protein levels of p21WAF1/CIP1/SDI1 were detected by Western blot and/or RTPCR, respectively. Results The ability of proliferation was decreased in rat mesangial cells with advancing age(P＜0.05).The expression of senescence associated βgalactosidase activity was increased in mesangial cells with advancing age. Percentages of SAβgal staining positive cells were (11.9±3.6)% versus (39.0±4.0)% versus (86.9±7.4)% (P＜0.05) in young, middle and aging glomerular mesangial cells. The p21WAF1/CIP1/SDI1 protein showed localization in nucleus in mesangial cells, and the staining intensity of p21WAF1/CIP1/SDI1 in mesangial cells in old animals was markedly increased, as compared to that in young and middle age rats (P＜0.05).The mRNA levels of p21WAF1/CIP1/SDI1 was significantly increased in mesangial cells in old animals, as compared to that at the age of 3 and 12 months, meanwhile the p21WAF1/CIP1/SDI1 proteins expression were dramatically increased with advancing age (P＜0.05). Conclusions The cellular phenotype and function are changed in rat mesangial cells with advancing age. The rat mesangial cells appear replicative senescence with advancing age. 　　【Key words】 Mesangial cells; Senescence; Phenotype；p21WAF1/CIP1/SDI1。

多数学者认为，器官衰老是由于其固有细胞功能减退所导致，肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞之一，具有调节肾血流量，分泌细胞外基质、炎症介质等功能，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。为了能客观真实地反映肾小球系膜细胞随衰老的变化，排除体外培养环境对细胞表型的影响，本研究应用自然衰老的24月龄大鼠，体外培养原代的肾小球系膜细胞，观察系膜细胞是否随机体增龄而衰老，以及老年大鼠系膜细胞p21WAF1/CIP1/SDI1表达的变化，为进一步研究系膜细胞衰老的作用机制奠定基础。

1 材料与方法。

1.1 原代大鼠系膜细胞培养 不同鼠龄雄性Wistar大鼠〔解放军总医院实验动物中心提供，SCXK(京)20050013〕15只，分3月龄组、12月龄组及24月龄组，每组各5只，无菌条件下取双侧肾脏，剥离肾包膜，用剪刀把肾皮质剪成碎块，放于重叠的3层不锈钢筛网上研磨，镜下观察，若见98%以上的肾小球脱去包曼氏囊，视野中基本上无肾小管存在，即可停止冲洗。收集第2层筛网上的组织移入离心管，V型胶原酶消化后，应用15％胎牛血清的RPMI 1640培养液，37℃、5％CO2条件下培养原代的系膜细胞，约7 d后第1次传代，传代的细胞24 h全部贴壁，生长迅速，形态为梭形或不规则星形，3～4 d已汇合成片，纯度极高，经鉴定结蛋白(Desmin)阳性、抗Ⅷ因子抗体阴性，传至第3代，用于实验。

1.2 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖能力 系膜细胞生长至80％融合，0.25％胰酶消化，计数后接种于96孔板，2 000个细胞/孔，细胞贴壁后，继续培养24、48、72、96、120 h，加入MTT(5 mg/ml)10 μl 孵育4 h后，加二甲基亚矾（DMSO）200 μl/孔裂解细胞，避光10 min，于492 nm波长记录吸光度值。

1.3 衰老相关半乳糖苷酶活性（SAβgal）染色 接种于6孔板中的各组细胞，待细胞生长至80％汇合，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，于室温固定细胞5 min，PBS液清洗3次后，加上新配制的含1mg/ml 5溴4吲哚βD半乳糖苷（Xgal）（美国Progrma公司）的SAβgal染液，置37℃（无CO2）温育12～16 h，PBS液清洗3次后，观察细胞胞浆中蓝色沉淀，用数码相机拍照。

1.4 RNA提取及反转录聚合酶链反应（RTPCR）分析 利用Trizol一步法提取肾小球系膜细胞总RNA，进行RTPCR。采用的引物序列如下：p21WAF1/CIP1/SDI1上游引物为：5′ CTG CCA GCT GCC CCT CTA TTT TG 3′，下游引物：5′ CAT CTT GGC CTG GCT CCT TGT A 3′，产物片段大小为373 bp；选用大鼠甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）为参照，上游引物：5′ TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC3′，下游引物：5′GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG3′，产物片段大小为191bp(北京赛百盛公司合成)。反应条件为94℃(5 min)→［变性94℃(45 s)→58℃退火(45 s)→延伸72℃(45 s)］×30个循环→72℃(7 min)。用AlphalmagerTM 2200凝胶图像分析系统(美国Alpha公司)，进行半定量分析。

1.5 蛋白质提取及Western印迹 将收集的细胞加入200 μl预冷的蛋白抑制率(RIPA)裂解液进行匀浆，4℃ 12 000／min离心25 min，吸取蛋白，经Micro BCA Protein Kit测蛋白浓度。取100 μg总蛋白，加2×十二烷基磷酸钠（SDS）上样缓冲液，100℃变性 5 min。进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离，将胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭4 h，加p21WAF1/CIP1/SDI1小鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)4℃过夜，二抗室温孵育1 h，Tris缓冲液（TBST）洗后用化学发光显影(ECL)(美国Santa Cruz公司产品)显色。所得结果以βactin (美国Santa Cruz公司产品)为参照，用UVP2000 凝胶图像分析系统(美国基因公司)进行半定量分析。

1.6 大鼠原代系膜细胞间接免疫荧光染色 不同组细胞贴壁后，用3％多聚甲醛＋2%蔗糖37℃固定10 min，PBS洗3 遍，冰上透化10min，PBS洗3遍，1％牛血清白蛋白（BSA）冰上封闭10 min，p21WAF1/CIP1/SDI1小鼠单克隆抗体，37℃孵育1 h，4℃过夜，含吐温20的TBST洗10遍，TRITC标记的山羊抗小鼠IgG，避光室温孵育1 h，TBST洗10遍，荧光显微镜下照相。

1.7 统计学处理 使用SPSS11.0软件进行统计分析，计量资料使用x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析。

2 结果。

2.1 不同月龄大鼠原代系膜细胞生长及表型特征 3、12及24月龄大鼠的原代系膜细胞均为长梭形或不规则星形，贴壁后生长迅速，约3～4 d后可传第1代。传代后，3、12月龄大鼠的系膜细胞仍保持旺盛的增殖能力，约2～3 d传1代，3月龄大鼠系膜细胞可传20代左右；而12月龄大鼠系膜细胞可传10代以上。24月龄大鼠的系膜细胞生长速度明显较3及12月龄大鼠系膜细胞减慢，约5～7 d才可传1代，群体倍增时间较前者系膜细胞延长1倍以上。而且传至第2～3代后，细胞肥大，形态变扁平、伸展，代谢减慢、生长停滞，失去增殖和传代能力。