苏拉明联合槲皮素抑制肺腺癌小鼠移植瘤 的转移

作者：张平，贺兼斌，王小华，欧立文。

【摘要】 目的 研究苏拉明联合槲皮素对小鼠肺腺癌转移的抑制作用。方法 将40只接种高转移性的LA795肺腺癌细胞T739小鼠随机分成5组：对照组、顺铂（DDP）组、槲皮素组、苏拉明组、苏拉明+槲皮素组。实验3周后，处死全部小鼠，取出双肺和剥离皮下肿瘤，计算肺转移发生率，计数各组小鼠肺表面转移结节数及算出肺表面结节转移抑制率，测量各组小鼠肺湿重。免疫组化和图像分析系统检测皮下移植瘤中微血管密度（microvessel density，MVD），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达并定量分析。结果 苏拉明组、槲皮素组与对照组相比肺表面转移结节数明显下降，同时苏拉明组中肺转移发生率、皮下肿瘤内MVD 、VEGF的表达与对照组相比也明显下降，相反顺铂组对此则无明显影响。联合用药组则显著抑制肺表面转移结节数且具有协同作用。结论 苏拉明和槲皮素对LA795肺腺癌的肺结节转移具有协同抑制作用，苏拉明抑制LA795肺腺癌转移与其抑制其肿瘤内VEGF表达相关。

【关键词】 苏拉明；槲皮素；血管生成抑制剂；肺腺癌；转移。

基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助项目(C2005033) Inhibitory Effect of Suramin Combination with Quercetin on the Metastasis of Lung Adenocarcinoma in Mice。

Key words：Suramin;Quercetin;Angiogenesis;Lungadencarcinoma;Metastasis。

目前肺癌发病率和死亡率都有明显增高趋势，腺癌为其一主要组织学类型，癌瘤内血管丰富，局部侵润和血行转移发生较早。转移是恶性肿瘤的重要特征，也是主要死因。自Folkmam[1]首先提出实体瘤生长需要血管生成理论后，抗血管治疗肿瘤转移也成为了当前肿瘤生物治疗的研究热点之一。本实验利用LA795肺腺癌细胞形成高转移T739小鼠皮下肿瘤转移动物复制模型 [2]，应用具有血管生成抑制作用的苏拉明及槲皮素，以顺铂为对照，观察单独及联合用药对LA795肺腺癌肺转移的抑制作用，并探讨其作用机制。

1材料和方法。

1.1实验动物、细胞株、药品及试剂。

T739雄性小鼠40只，鼠龄4～5周，均重20g左右， LA795肺腺癌荷瘤鼠两只，均由中国医学科学院肿瘤医院动物室提供（合格证号SCXK11000005），南华大学肿瘤研究所提供SPF级饲养环境。顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司，苏拉明（Suramin）及槲皮素（Quercetin）购于美国Sigma公司，VEGF兔抗鼠单抗购于美国Santa Cruz生物科技公司，CD34免抗鼠一抗、广谱型SP试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物工程公司。

1.2动物模型的建立。

处死两只荷瘤鼠，剥离瘤块，研磨成匀浆液，过360目钢网，生成肿瘤细胞悬液，镜下调节细胞浓度为2×106个/ml，于每只小鼠右后腿根部外侧皮下注射0.2ml瘤液，形成小鼠高转移性动物肿瘤模型。

1.3分组及用药。

小鼠皮下移植处均成瘤，接种4d后随机分成5组，每组8只。(1) 对照组:丙二醇0.2ml+生理盐水0.2ml /只腹腔注射（iq），每天一次；(2) 顺铂组:顺铂2mg/(kg·d)溶于生理盐水0.2ml中iq，于接种后第4、11、18d各一次，并予丙二醇0.2ml/只每天腹腔注射一次；(3) 槲皮素组:槲皮素50mg/(kg·d)溶于丙二醇0.2ml中iq，每天一次；(4) 苏拉明组:苏拉明10mg/(kg·d)溶于生理盐水0.2ml中iq，每天一次；(5) 槲皮素+苏拉明组:槲皮素及苏拉明按3、4组用药。

1.4方法与观察指标。

1．4．1药物对肿瘤转移的影响。

肿瘤接种24d处死小鼠，剥离皮下肿瘤，剖胸观察双肺表面肿瘤转移情况，计数肺表面转移结节数，肺表面结节转移抑制率=（1用药组平均转移结节数/对照组平均转移结节数）×100%,称肺湿重。肺及皮下肿瘤置入4%的中性甲醛固定，石蜡包埋，组织切片（4μm）行HE染色及免疫组化染色。

1．4．2移植瘤内VEGF、MVD的表达。

采用免疫组化SP法检测，方法步骤严格按试剂盒说明书进行（皆1∶100稀释为工作液），用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。VEGF的判定标准，肿瘤细胞浆及胞膜呈棕黄色为阳性细胞，LuzexF图像分析系统测定肿瘤组织中VEGF平均灰度值(其灰度值越低，则VEGF表达水平越高，反之亦然)，将每张切片在40倍镜下随机测10个视野，用平均灰度值评价染色强度。MVD判断标准参考Weidner等[3]方法。结果以±s表示。