环磷酰胺免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体小鼠模型的建立

作者：郭紫芬 何淑雅, 朱炳阳, 廖端芳。

【摘要】 目的: 观察不同剂量环磷酰胺(CP)诱导免疫耐受的作用, 建立一个免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体（mAb）的动物免疫模型。方法: 雌性 BALB/c小鼠经CHO细胞免疫后分别给予不同剂量的CP诱导免疫耐受, 选择血清抗体效价最低的一组小鼠按常规方式腹腔注射CHOTM5细胞进行免疫。ELISA测定各小鼠血清中CHO抗体及CHOTM5抗体效价, 检测血清抗体对CHO细胞与CHOTM5细胞结合反应的差异性。结果: BALB/c小鼠腹腔注射不同剂量的CP后, 各剂量组均出现不同程度的免疫耐受作用。CP 100 mg/kg组与CP 125 mg/kg组小鼠血清抗体效价较低, 接近阴性对照组。ELISA检测显示CP 100 mg/kg组血清抗体与CHOTM5细胞呈阳性结合反应, 不与CHO细胞结合; 而CP 0 mg/kg组血清抗体与CHO细胞与CHOTM5细胞的结合反应均呈阳性。结论: CP 100 mg/kg具有良好诱导小鼠对CHO和CHOTM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受, 相对增强对CHOTM5细胞目的抗原hTM的免疫应答的作用, 为免疫删减法制备细胞表面抗原mAb提供了一个理想的动物免疫模型。

【关键词】 免疫耐受; 环磷酰胺; 细胞表面抗原; ELISA。

环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)是一种非特异性免疫抑制剂, 可抑制各种动物的体液与细胞免疫应答［1, 2］, 与抗原联用时能选择性杀伤针对外来抗原迅速增殖B细胞, 并诱导机体在一定时期内对该抗原产生特异性免疫耐受, 而不影响机体免疫系统对其他抗原的识别。国内外学者已将环磷酰胺免疫删减法成功用于单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的制备［3—5］ 。但CP免疫删减作用效果难以控制, 给药剂量和给药时间是十分关键的因素。因其不能完全抑制抗非目的抗原抗体的产生, 而药物本身的毒性作用往往可引起小鼠免疫系统的全面抑制, 使小鼠因感染等原因而死亡, 导致免疫的失败。本研究拟针对细胞表面目的抗原提纯方法繁琐或提纯困难的特点, 进行了CP免疫删减法的动物模型研究, 为制备细胞表面抗原mAb的动物免疫模型选择提供参考依据。

1 材料和方法。

1.1 材料 环磷酰胺为上海第三制药厂产品; 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG为法国Immunotech公司产品; BALB/c小鼠购自中国科学院上海动物实验中心。CHO细胞株由南华大学药物药理研究所提供; 携带目的抗原 hTM的CHOTM5细胞株本人构建并保存于南华大学药物药理研究所。M750B紫外分光光度仪为江苏泰州无线电仪器厂产品; CO2培养箱为日本Sanyo公司产品; COCI型倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品; DG5301型酶联免疫检测仪为国营华东电子管厂产品。

1.2 方法。

1.2.1 动物分组 将8～10周龄BALB/c雌性小鼠分为8组, 每组3只: ①CP 0 mg/kg组; ②CP 25 mg/kg组; ③CP 50 mg/kg组; ④CP 75 mg/kg组; ⑤CP 100 mg/kg组; ⑥CP 125 mg/kg组; ⑦CP 150 mg/kg组; ⑧阴性对照组, 不用任何抗原刺激, 亦不应用CP。

1.2.2 动物免疫 取生长良好的CHO细胞以无菌PBS洗涤3遍, 终以无菌PBS悬浮, 调整细胞密度至2×1010/L, 对8周龄的雌性BALB/c小鼠行腹腔注射(1×107/只), 而后分别于10 min、 24 h、 48 h给小鼠腹腔注射不同剂量的免疫删减剂药物CP。2周后重复此过程, 诱导小鼠对CHO和CHOTM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受。第2次CHO细胞免疫后10 d, 眼眶取血测定各小鼠血清中抗体效价, 选取抗体效价最低的一组小鼠与CP 0 mg/kg组, 经过2周后再按常规方式腹腔注射生长状态良好的携带目的抗原hTM的CHOTM5细胞免疫小鼠(5×106/只), 共免疫3次, 免疫间隔时间为2周。

1.2.3 ELISA检测小鼠血清抗体效价及与细胞的反应性 第2次CHO细胞免疫后10 d, 眼眶取血ELISA测定各小鼠血清中CHO抗体效价, 检测抗体对CHO细胞的结合反应性。在包被有CHO细胞的聚氯乙烯ELSIA板中加入不同滴度的血清, 37℃温育2 h后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG继续37℃温育2 h, 邻苯二胺显色液显色后在酶标仪上测定490 nm波长时的A值。设阴性对照组小鼠血清为阴性对照, 2 g/L BSAPBS为空白对照。根据测定结果选取抗体效价最低的一组小鼠与CP 0 mg/kg组, 按常规方式用携带目的抗原hTM的CHOTM5细胞免疫。第3次CHOTM5细胞免疫后3 d, 尾静脉取血, 方法同前进行ELISA法测定小鼠血清中CHOTM5抗体效价, 同时检测抗体对CHOTM5及CHO细胞的结合反应的差异性。

1.2.4 统计学分析 所有数据均用x±s表示, 用方差分析及两两t检验进行统计分析, 以P0.05为差异有统计学意义。

2 结果。

2.1 不同剂量环磷酰胺诱导小鼠对CHO细胞免疫耐受的影响 CP 0 mg/kg组由于没有免疫删减剂CP的抑制作用, 血清中抗CHO细胞抗体效价最高, 抗体滴度＞1∶10 000, 是我们此次实验研究用来评价CP免疫删减法增强小鼠对CHOTM5细胞株的细胞表面目的抗原hTM的免疫应答效果的CP对照组。除CP 150 mg/kg组3只小鼠全部死亡外, 其余CP各剂量组小鼠血清与CHO细胞均有不同程度的结合反应, 与CP 0 mg/kg组比较(P0.05), 有统计学意义, 不同剂量的CP对小鼠有不同程度的免疫删减作用。CP 100 mg/kg组与CP 125 mg/kg组小鼠血清抗体效价较低, 均接近阴性对照组, 并且经过两两比较, 无统计学意义(图1)。因此, 为了避免CP剂量过大带来的毒副作用, 选择较小剂量组CP 100 mg/kg组的小鼠准备后续CHOTM5细胞免疫。

2.2 环磷酰胺增强小鼠对CHOTM5细胞目的抗原hTM的免疫应答 CP 100 mg/kg组血清中抗CHOTM5细胞抗体效价为1∶2 000, 与CHOTM5细胞有较好的结合反应性, 与0 mg/kg组及阴性对照组比较, 有统计学意义(P0.05, 图2)。ELISA检测血清抗体（血清滴度为1∶2 000）与CHO及CHOTM5细胞结合反应差异性的结果显示: 0 mg/kg组血清与CHO细胞及CHOTM5细胞均能发生较好的结合反应, 而CP 100 mg/kg组血清只与CHOTM5细胞有较好的结合反应性, 而与CHO细胞不结合（图3）。