调中颗粒对大鼠混合反流性食管炎的治疗作用及其机制

作者：时昭红, 苏文, 张介眉, 郝建军, 冯云霞, 陈洲。

【摘要】 目的：观察调中颗粒对混合反流性食管炎大鼠食管黏膜病理改变及血清氧自由基的影响，探讨调中颗粒治疗反流性食管炎的作用机制。方法：58只SD大鼠随机分成5组：调中颗粒组、半夏泻心汤组、西沙必利组、模型组和假手术组。通过食管十二指肠端侧吻合术法复制混合反流性食管炎大鼠模型，造模结束后灌胃给药，连续给药12 d后处死大鼠，HE染色法观察病理变化，免疫组织化学SABC法检测大鼠食管黏膜中肿瘤抑制蛋白质p53和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表达，比色法检测血清中丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSHPx）的活性。结果：治疗结束后，与模型组比较，调中颗粒组、半夏泻心汤组和西沙必利组大鼠食管黏膜组织病理改变有不同程度的修复。与模型组比较各治疗组血清MDA含量下降（P0.05, P0.01），SOD和GSHPx活性升高（P0.05, P0.01），p53和PCNA表达减少（P0.01）。调中颗粒在降低MDA含量、提高SOD和GSHPx活性方面优于西沙必利片（P0.05），减少PCNA和p53表达方面优于半夏泻心汤和西沙必利片（P0.05）。结论：调中颗粒可以降低MDA的含量，提高SOD和GSHPx的活性，减少PCNA和p53的表达，促进黏膜的修复，可能为其治疗反流性食管炎的作用机制。

【关键词】 食管炎, 反流性; 复方; 氧自由基; 增殖细胞核抗原; 肿瘤抑制蛋白质p53; 大鼠。

Objective: To explore the mechanism of Tiaozhong Granule (TZG), a compound traditional Chinese herbal medicine, in treating rats with mixed reflux esophagitis.Methods: Fiftyeight SD rats were randomly divided into untreated group (n=12), shamoperated group (n=10), TZGtreated group (n=12), Banxia Xiexin Decoction (BXXXD)treated group (n=12) and cisapridetreated group (n=12). Mixed reflux esophagitis was induced by esophagoduodenum endtoside anastomosis. Four weeks later, the rats were orally administered twice daily for 12 days. Pathological changes of esophagus mucous membrane were observed by using HE staining. The expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and p53 in the esophagus tissue were detected by immunohistochemical SABC method. Spectrophotometric method was used to detect the content of malondialdehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSHPx) in serum.Results: Compared with the untreated group, pathological changes of esophagus mucous membrane were relieved in different degrees in TZGtreated group, BXXXDtreated group and cisapridetreated group. Content of MDA and expressions of PCNA and p53 were obviously decreased in the three treated groups (P0.01), and the activities of SOD and GSHPx were significantly increased in the three treated groups (P0.05, P0.01). TZG had better effects than cisapride in decreasing the content of MDA and increasing the activities of SOD and GSHPx (P0.05). TZG was better in aspect of reducing the expressions of PCNA and p53 than BXXXD and cisapride tablets (P0.05).Conclusion: Tiaozhong Granule can treat mixed reflux esophagitis in rats, and its action mechanisms may be associated with decreasing the expressions of PCNA and p53 in esophagus mucous membrane, reducing the content of MDA and increasing the activities of SOD and GSHPx in serum.

Keywords: esophagitis, reflux; compound recipe (TCD); oxygen radicals; proliferating cell nuclear antigen; tumor suppressor protein p53; rats。

反流性食管炎（reflux esophagitis, RE）是一种以胃肠内容物反流入食管造成黏膜损伤为特征的常见消化道疾病。近年来其并发的Barrett食管（Barrett‘s esophagus, BE）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）的发病率有增高趋势［1］，但目前该病的西药疗效尚不能令人满意。调中颗粒（Tiaozhong Granule, TZG）原名胃必欢，是临床运用20余年，已通过湖北省食品药品监督管理局院内制剂审批（批准文号：鄂药制字2005第z01112号）的治疗RE的经验方剂，为进一步探讨其疗效及作用机制，我们在成功建立混合RE大鼠模型的基础上，观察调中颗粒对食管黏膜的影响。

1 材料与方法。

1.1 实验材料。

1.1.1 动物。

清洁级健康SD大鼠，雌雄各半，体质量（180±20）g。由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（合格证号：19058；编号：TJLA2005308）。

1.1.2 药物。

调中颗粒（姜半夏10 g、黄连6 g、黄芩8 g、炮姜3 g、太子参15 g、甘草6 g、大枣10 g、杏仁10 g、厚朴10 g）由武汉市中西医结合医院制剂室提供（批号：050408），6 g/袋，用蒸馏水稀释成浓度为2 g/ml的溶液(按颗粒剂计算)。半夏泻心汤（半夏12 g，黄芩、干姜、党参、炙甘草各9 g，黄连3 g，大枣4枚）药物及制剂（制备成浓度为1.74 g/ml的汤剂，按生药计算）由武汉市中西医结合医院制剂室提供（批号：050607）。西沙必利片，5 mg/片，由西安杨森制药有限公司生产（国药准字H1096289，批号：040521939），用蒸馏水稀释成0.02 mg/ml的溶液。

1.1.3 主要仪器与试剂 　　BX60型Olympus光学显微镜和Olympus BX50显微摄影系统由日本奥林巴斯公司生产；HUMIAS2000医学图文分析系统由武汉千屏影像技术有限责任公司提供；TU1800S型紫外分光光度计由北京普析通用公司生产；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSHPx）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；鼠抗人肿瘤抑制蛋白质p53单克隆抗体、鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）单克隆抗体、SABC免疫组化染色试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 实验方法。

1.2.1 分组及喂养。

考虑动物模型复制过程中动物有一定的死亡率［1］，酌情调整各组大鼠数量。58只SD大鼠运用随机数字表随机分组，调中颗粒组、半夏泻心汤（Banxia Xiexin Decoction, BXXXD）组、西沙必利组和模型组，每组12只，假手术组10只。分笼饲养于钢丝网底塑料笼内，每笼4只，每组3笼，自由取食。

1.2.2 混合反流性食管炎模型的建立。

造模方法参照王雯等［2］的食管十二指肠端侧吻合术法。大鼠适应环境4～7 d后，用1%戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg，腹腔注射），将大鼠固定于手术台，取上腹部正中切口进腹。进腹后将食管下段分离出神经和血管，结扎贲门，切断食管，缝合贲门并荷包包埋入胃中，保留全胃。于距幽门约1 cm处纵行切开十二指肠壁约0.5 cm，与食管下端行食管十二指肠端侧吻合术，关腹前腹腔内注入生理盐水1 ml及硫酸庆大霉素2万U。术后禁食24 h，不禁水。观察大鼠饮食、粪便及活动情况。假手术组行假手术，进腹后将食管下段分离出神经和血管后关腹。造模时间为4周。造模过程中因部分大鼠不能耐受实验而死亡，造模结束时调中颗粒组、半夏泻心汤组、西沙必利组、模型组、假手术组分别剩余10、9、8、9、10只大鼠。

1.2.3 给药与取材方法。

造模成功24 h后开始灌胃给药，调中颗粒组予调中颗粒10.03 g/(kg·d)、半夏泻心汤组予半夏泻心汤8.71 g/(kg·d)，西沙必利组给予西沙必利片0.09 mg/(kg·d)，假手术组和模型组给予同体积的生理盐水灌胃，每天2次，共给药12 d。给药结束后禁食不禁水12 h，心脏取血，置于5 ml的抗凝采血管中，3 500 r/min，离心10 min，取上清备用。自胃食管交界部位向上1 cm处（向咽喉方向）取一段长约1 cm的食管，固定于10％福尔马林中，HE染色后光镜观察病理改变。同时取食管下端大小约为0.5 cm×0.5 cm食管壁全层一块，立刻置于4 ℃ 4%的多聚甲醛中固定2 h，用于免疫组化检测。