苦参碱靶向缓释纳米球的制备及影响因素考察

作者：陈纭，金涌，李俊，黄晓晖，王凤娟，苏峰。

【摘要】 　　目的制备肝靶向缓释苦参碱纳米球，并对其形态，载药量，包封率及药物利用率等纳米球质量进行研究。方法采用乳化溶剂挥发法制备苦参碱—PLGA—纳米球，并用透射电镜观察其外观形态，利用高效液相色谱（HPLC）测定药物含量。结果制得肝靶向缓释苦参碱—PLGA—NS，其平均包封率为79.5%，平均载药量为1.75%，平均粒径为190.5 nm。结论制备苦参碱—PLGA—NS基本达到设计要求，该制剂有望成为一种新的药物靶向载体系统。

【关键词】 苦参碱 乳酸—羟基乙酸共聚物（PLGA） 纳米球。

苦参碱（matrine）是从豆科槐属植物山豆根Sophora tonkinensis Gagnep分离提取的氧化苦参碱和极少量槐果碱的混合物，具有抗炎，抗病毒，促免疫机制和抗肿瘤等作用，近年来发现它对病毒性肝炎亦有明显治疗作用［1～3］。纳米给药系统在实现靶向和缓释给药，以及提高难溶性药物的生物利用度，降低药物毒副作用等方面具有良好的应用前景［4，5］。高分子材料乳酸—羟基乙酸共聚物(PLGA)，因其优良的生物相容性和生物降解性，被广泛用作纳米球（nanosphere，NS）的载体材料，以其为载体的NS克服了纳米乳剂、纳米脂质体药物易泄露等缺点，成为国内外的研究热点之一，为一类新型的靶向给药载体［6］。 　　本实验以PLGA为载体，Pluronic F68为乳化剂，成功地制备了粒径大小适中的KU—PLGA—NS。此制剂经脉管给药后可显著聚集于肝脏并缓慢释药，这种由肝脏枯否氏（kupffer）细胞吞噬所致的被动靶向作用无疑有利于肝位病灶尤其是肝炎等的治疗［7，8］。

1 材料与仪器。

1.1 仪器79—1型磁力搅拌器（金坛市杰瑞尔电器有限公司），AG285型电子天平（瑞典METTLER TOLEDO 公司），岛津高效液相色谱仪（包括LC—20AB泵，SPD—M20A紫外检测器及岛津Lcsolution色谱工作站），C18色谱拄（依利特），超速冷冻离心机，纳米粒径分析仪（英国Malrern仪器公司），JEOL型高分辨透射电镜（日本电子株式会社），0.45 μm微孔滤膜。

1.2 试剂苦参碱（陕西龙孚生物化工有限责任公司）,PLGA（LA/GA=75/25，MW=8 600，济南岱罡生物科技有限公司）,Pluronic F—68（西安罗森伯科技有限公司），1.5%（W/V）磷钨酸，甲醇（色谱纯），丙酮等其他试剂均为分析纯。 　　标准溶液的配制： 　　水相：0.5%pluronicF—68，称取Pluronic F—68 0.5g 溶于100 ml的纯化水中，备用。 　　油相：精密称取苦参碱19.7 mg；PLGA（75/25）83.5 mg溶于5ml丙酮中，备用。 　　流动相的配制：取70 ml甲醇加入30 ml水混匀，再加入0.772 g KH2PO4混匀，再加入30 μl三乙胺，备用。

2 方法。

2.1 苦参碱—PLGA—NS胶体溶液的制备取3 ml已配好的油相，将其用注射器针头缓慢注入到以一定速度（以不起泡为宜）搅拌的100 ml Pluronic F—68 水相中，常温下磁力搅拌除尽丙酮，搅拌时间以3 h为宜。经0.45 μm微孔滤膜过滤即得苦参碱—PLGA—NS胶体溶液。低温避光保存。

2.2 形态及粒径观察取KU—PLGA—NS胶体溶液适量，少量纯化水稀释后用1.5%（W/V）磷钨酸负染色，滴于镀膜的电镜铜网上，晾干后，置于透射电镜下观察纳米球的外观形态并拍摄照片。

2．3 色谱条件［9］C18色谱拄（大连依利特）；流动相为甲醇—水—三乙胺（70∶30∶0.009）；检测波长：229 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl。

2.4 包封率、载药量及利用率的测定精密吸取苦参碱—PLGA—NS胶体溶液500 μl超速冷冻离心（45 000 r·min—1）2 h，精密吸取上清液10 μl，HPLC法测定苦参碱含量。计算未包封苦参碱的量（M1），再精密吸取苦参碱—PLGA—NS胶体溶液500 μl，用一定体积的混合有机溶剂溶解苦参碱和PLGA，测得苦参碱的总量，计算胶体溶液中苦参碱的含量（M2），MPLGA为PLGA的投药量，按下式计算包封率，载药量和药物利用率。 　　包封率（%）=（M2—M1）/M2×100% 　　载药量（%）=（M2—M1）/MPLGA×100% 　　药物利用率（%）=M2/投药量×100%。

3 结果。

3.1 透射电镜观察纳米球呈类球形，分布较均匀，电镜下计数500个纳米球，得平均粒径为（190.5 nm），苦参碱—PLGA—NS的透射电镜照片见图1。

图1 苦参碱—PLGA—NS的透射电镜照片（略）。

3.2 HPLC测定药物含量［9］在本实验的色谱流动相条件下10 mg/L浓度苦参碱标准品溶液进样10 μl，见图2。

图2 苦参碱标准品溶液HPLC图（略）。

3.3 标准曲线利用HPLC测定药物含量，用苦参碱标准品配制不同浓度溶液，以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=5.07×105X+5.31×103，曲线见图3。

图3 苦参碱标准品回归方程曲线（略）。

3.4 利用HPLC测得苦参碱色谱峰面积，并通过标准回归方程计算得出M1 ，M2；通过“2.4”项中计算包封率，载药量及药物利用率的公式计算得肝靶向缓释苦参碱—PLGA—NS的平均包封率79.5% ，平均载药量为1.75%，平均药物利用率为19.6%。

3.5 影响因素的考查本实验采用单因素考查，只改变被考查因素的量值，其他条件不变；以载药量（DL），包封率（EE），药物利用率（DA），平均粒径（Dm）等作为因素考查的质量评价指标。实验采取3次平衡实验所得数据求得平均值和标准差，其中标准差的计算公式为： 　　σ=1NNi=1(xi——x)2。

3.5.1 PLGA的浓度将PLGA用丙酮配制成不同浓度的溶液，制成苦参碱—PLGA—NS，并测定DL，EE，DA和Dm等结果见表1。

表1 PLGA的浓度对纳米球质量的影响（略）。

由表1可见，不同用量的PLGA对DL，EE，DA有明显影响，在一定范围内随着PLGA浓度的增加，使苦参碱—PLGA—NS的DL，EE，DA均有所增加。但随PLGA浓度的增加溶液较难通过0.45 μm微孔滤膜，也难形成纳米级的颗粒纳米球收率较低，使DL，EE，DA均降低。

3.5.2 理论载药量以0.5%Pluronic F68水溶液为水相，PLGA的浓度为16.7 g/L，在其他条件不变的情况下，改变苦参碱药物的投药量，制备苦参碱—PLGA—NS，并对苦参碱—PLGA—NS的DL，EE，DR和Dm进行测定。结果见表2。

表2 投药量对纳米球质量的影响（略）。

由表2可见，改变投药量对DL，EE，DR有明显影响，随着用量的增加使实际载药量显著增加，粒径也会增大，但DL，EE，DR均减少。

3.5.3 Pluronic F68 浓度将Pluronic F68配制成不同浓度的溶液，制备苦参碱—PLGA—NS，并对其DL，EE，DR和Dm进行测定。结果见表3。 　　由表3可见，Pluronic F68在一定浓度范围内（0.1%～0.5%）时，DL，EE，DR和Dm均改变较小；但当其浓度继续增大时，DL，DA显著增大，到达0.5%时最大;可是继续增加浓度（到10%）时，DL，EE，DR会明显下降。

表3 PLuronic F68浓度对纳米球质量的影响（略）。

3.5.4 水相的用量以0.5%Pluronic F68水溶液为水相，PLGA的浓度为16.7g/L，油相体积不变，水相体积增加，制备苦参碱—PLGA—NS，并对其DL，EE，DR和Dm进行测定。结果见表4。