两个玉米自交系对纹枯病的抗病反应机制初探

组织细胞生理生化反应，如抗氧化物酶激活、活性氧积累、细胞坏死反应及抗病相关基因的表达等[910]。研究植物与病原菌互作中的抗病反应信号，对于揭示植物的抗病机制具有重要意义。

玉米自交系18599R和 R08均具有较高的配合力、遗传背景单一、高产、抗逆、综合性状优良等特性，是西南地区玉米转基因工程育种研究领域重要的优良受体自交系，但关于其对纹枯病的抗病机制尚不清楚[1112]。本试验以18599R和 R08为研究材料，以纹枯病菌（R.solani） 菌丝融合群AG1IA为供试菌株，通过AG1IA接种后，对成株期玉米进行抗性鉴定， 并对接种后不同时间点自交系苗期叶片中的活性氧（ROS）、抗病相关基因表达及细胞坏死情况进行测定，初步研究两个自交系对纹枯病的抗病机理，为玉米抗纹枯病育种提供依据。

1 材料与方法。

1.1 材料。

供试玉米自交系18599R和R08由四川农业大学玉米研究所提供；立枯丝核菌（R.solani）融合群菌株AG1IA由四川农业大学植物病理系实验室提供。

1.2 生化试剂及仪器。

RNA提取试剂盒：TrizolReagent试剂（Invitrogen， USA）、TrizolMate（Tiandz）购自天根公司；反转录试剂盒：PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa），购自上海宝生物公司；PCR试剂盒：Taq PCR Master Mix（BioBasic）购自成都温江区瑞金特公司；台盼蓝（Trypan blue）、核酸染料、琼脂糖及其他试剂均购自成都市温江区博大泰克公司；二氨基联苯胺DAB（3，3diaminobenzidine）试剂盒购自Sigma公司；台式高速冷冻离心机（5424R，Eppendorf）、真空抽滤泵（Vacuubrand CVC2）、PCR基因扩增仪（1000TM Thermal Cycler，BioRad）、电泳仪（DYY6C型，北京六一仪器厂）、凝胶成像仪（Universal Hood II，BioRad）由四川农业大学农学院植物病理系提供。

1.3 试验方法。

1.3.1 实验室育苗及病原菌活化。

将自交系18599R和R08的种子用75%乙醇处理1 min，然后用5%的次氯酸钠处理10 min，蒸馏水冲洗3～5次，将消毒后的玉米种子置于放有浸润卫生棉的培养皿中，置于生长温度25～28℃，相对湿度75%的温箱中培养催芽，1 d后取出移栽于装有灭菌基质土的直径34 cm，高23 cm的花盆中。每个自交系玉米种5盆，每盆种3株玉米。

将处于保存状态下的AG1IA接入马铃薯葡萄糖琼脂（又称PDA）平板培养基上（马铃薯200 g，葡萄糖10 g，琼脂8 g，水1 000 mL），并置于25～28℃恒温下扩大培养至长满整个培养皿待用。

1.3.2 抗性鉴定及病斑扩展情况观察。

在玉米大喇叭口期对其接种，并于乳熟期进行抗性鉴定。将AG1IA菌饼接种于玉米第6叶鞘部位，用保鲜膜包扎保湿，置于（25±3）℃，L∥D=16 h∥8 h的人工气候室内培养，到乳熟期观察并记录发病情况，病害分级及抗性评价标准参考黄天述等[8]的方法。病情分级标准如下：0级，全株不发病；1 级，果穗位下第4叶鞘及以下叶鞘发病；3级，果穗位下第3叶鞘及以下叶鞘发病；5级，果穗位下第2叶鞘及以下叶鞘发病；7级，果穗位下第1叶鞘及以下叶鞘发病；9级，果穗位及其以上叶鞘发病。对玉米抗病性评价依据病级划分为不同抗病类型：免疫（I，0级）、高抗（HR，1级）、抗（R，3级）、中抗（MR，5级）、感（S，7级）和高感（HS，9级）。