多房棘球绦虫重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗诱导小鼠细胞因子变

【摘要】 目的: 研究多房棘球绦虫重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗对原头蚴攻击小鼠细胞因子变化的影响。方法: 将重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗分别通过皮下注射、 肌肉注射、 鼻腔黏膜接种和口服接种免疫BALB/c小鼠12周后, 用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击, 攻击感染后18周剖杀小鼠, 取脾脏制备淋巴细胞悬液体外培养, 分别以多房棘球绦虫抗原(EmAg)、 刀豆素A(ConA)刺激诱生白细胞介素12(IL12)、 白细胞介素10(IL10)和干扰素γ(IFNγ); 以脂多糖(LPS)刺激诱生肿瘤坏死因子α(TNFα)。常规ELISA测定脾细胞培养上清液中IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα水平。结果: 与对照组相比,疫苗免疫组IFNγ、 IL12、 TNFα水平增加, IL10水平降低, EmAg刺激组和ConA或LPS刺激组细胞因子水平明显高于相应的原液组。结论: 多房棘球绦虫重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗可诱导攻击感染小鼠产生Th1型细胞免疫应答, 增强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应。

【关键词】 多房棘球绦虫 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗 原头蚴 细胞因子。

泡型包虫病(alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球绦虫(echinococcus multilocularis, Em)的续绦期幼虫寄生在人体引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病(zoonosis)。泡球蚴在宿主肝脏呈现酷似肿瘤的侵润性生长, 可诱发宿主的体液免疫和细胞免疫［1］。初始T细胞获得泡球蚴抗原识别信号而活化为效应T细胞, 通过细胞因子而进行免疫调节。近年来研究发现, Thl和Th2细胞产生的细胞因子在病程转归中具有重要作用, 可反映宿主机体内免疫应答的反应类型。李富荣等［2］报道小鼠感染泡球蚴后的前12周脾淋巴细胞以分泌IL2R和TNFα为主, 前8周呈Th1反应; 12周后以IFNγ为主; 16周后以IL1为主, 感染后期Th2反应逐渐增强; 舒勍［3］发现A/J小鼠对泡球蚴有相对较强的抵抗力与T细胞增生导致高水平的Th1细胞因子IL2和IFNγ有关; 魏晓丽等［4］报道IFNγ、 TNFα等Th1型细胞因子接种泡球蚴后水平均上升, 而IL4、 IL10 等Th2型细胞因子相对维持较低水平, 这些资料表明细胞因子在宿主对泡球蚴的免疫应答中可能起重要作用。本研究在成功构建重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗［5］的基础上, 用该疫苗免疫小鼠, 然后用多房棘球绦虫原头蚴攻击感染, 研究Thl和Th2型细胞因子的变化, 探讨该疫苗的保护性免疫机制。

1 材料和方法。

1.1 材料 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗［5］由本室构建和保存; Bb购自武汉大学菌种保存中心。纯系BALB/c小鼠(雌性, 体质量20～25 g, 12～14周龄, 共78只)购自重庆医科大学实验动物中心。ConA购自Sigma公司; RPMI1640培养基、 100 g/L BSA、 青霉素和链霉素购自上海生工公司; IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα检测试剂盒购自北京晶美公司。

1.2 方法。

1.2.1 实验分组 78只雌性BALB/c小鼠随机分为6组, 每组13只。SC组: rBbEmⅡ/3Em1433皮下注射组; IM组: rBbEmⅡ/3Em1433肌肉注射组; IN组: rBbEmⅡ/3Em1433鼻腔黏膜接种组; PO组: rBbEmⅡ/3Em1433口服接种组; Bb对照组: 100 μL Bb菌液皮下注射组; PBS对照组: 100 μL PBS皮下注射组。SC、 IM组: 5×106 CFU疫苗悬浮于100 μL PBS于小鼠后背部皮下单次及肌肉注射; IN组: 5×105 CFU疫苗悬浮于10 μL PBS于小鼠鼻腔黏膜单次接种; PO组: 1×108 CFU疫苗悬浮于60 μL PBS进行口服接种。至室验结束时, SC、 IN组有3只小鼠死亡, PO组有4只小鼠死亡, IM、 Bb、 PBS组各有1只小鼠死亡。

1.2.2 攻击感染 疫苗免疫小鼠12周后, 用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击感染。

1.2.3 脾细胞制备 原头蚴攻击感染后18周随机挑选各组小鼠8只剖杀, 750 mL/L乙醇消毒3 min, 无菌取脾, 剪碎, 用注射器针芯碾磨, 1 mL8.5 mL/L生理盐水冲洗, 200目尼龙网过滤, 滤液置10 mL离心管; 加4 mL双蒸水使渗透压降至0.15%溶解红细胞, 10 s, 再加1.34 mL36 mL/L生理盐水恢复等渗; 用8.5 mL/L生理盐水洗2次, 2500 r/min离心5 min, 加入10 mL8.5 mL/L生理盐水混匀, 计数细胞, 调整细胞密度为5×109/L, 加入含100 g/L BSA的RPMI1640培养液10 mL, 加入青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL。

1.2.4 脾细胞培养上清液的制备 将5×109/L脾细胞加入24孔细胞培养板, 每份标本设6孔, 分别加入1 mL原液、 1 mL 原液＋EmAg 10 mg/L、 1 mL原液＋ConA 10 mg/L、 1 mL原液、 1 mL原液＋EmAg 10 mg/L和1 mL原液＋LPS 10 mg/L, 前3孔37℃50 mL/LCO2培养48 h, 4000 r/min离心5 min, 收集上清液, —20℃冰箱冻存待查IL12、 IL10和IFNγ; 后3孔37℃50 mL/LCO2培养72 h, 4000 r/min离心5 min, 收集上清液, —20℃冰箱冻存待查TNFα。

1.2.5 脾细胞产生的IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα检测 按ELISA试剂盒说明书的实验步骤, 对小鼠血清中IL12、 IL10、 IFNγ和TNFα的含量分别进行检测, 酶标仪测定A450值, 以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线, 计算细胞因子含量。

1.2.6 统计学分析 各组小鼠脾细胞产生的4种细胞因子浓度采用SPSS13.0软件进行分析, 计量资料采用t检验（x±s）, 检测结果采用方差分析, 组间两两比较用LSD。

2 结果。

2.1 IFNγ检测结果 SC～PO组中, 小鼠脾细胞原液组、 EmAg刺激组和ConA刺激组IFNγ水平均明显高于PBS对照组(P0.01); Bb对照组与PBS对照组相比, 差别无统计学意义; 每个ConA刺激组IFNγ水平明显高于相应的原液组或EmAg刺激组(P0.05或P0.01)。在EmAg刺激组和ConA刺激组中, SC组IFNγ水平明显高于IM组、 IN组和PO组(P0.05或P0.01), IM组、 IN组和PO组之间无统计学意义(表1)。

表1 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫原头节攻击后小鼠IFNγ的检测（略）。

Tab 1 Detection of IFNγ in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscoleces。

bP0.01 vs PBS control group.

2.2 IL12检测结果 SC组和IN组小鼠脾细胞原液组、 EmAg刺激组和ConA刺激组IL12水平均明显高于PBS对照组(P0.05或P0.01); IM组、 PO组和Bb对照组与PBS对照组相比, 差别无统计学意义。EmAg刺激组和ConA刺激组中, SC组IL12水平明显高于IM组和PO组(P0.05或P0.01), 余无统计学意义。每个ConA刺激组IL12水平明显高于相应的原液组或EmAg刺激组(P0.05或P0.01); 每个EmAg刺激组IL12水平明显高于相应的原液组(P0.05或P0.01, 表2)。

表2 重组BbEmⅡ/3Em1433疫苗免疫原头节攻击后小鼠IL12的检测（略）。

Tab 2 Detection of IL12 in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscoleces。