黄芪皂苷I对Th1免疫反应的调节效应及机制研究
方法构建丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖细胞模型，测定黄芪皂苷I对ConA诱导T淋巴细胞增殖和LPS诱导B淋巴细胞增殖反应，构建anti—CD3 mAb抗体诱导T淋巴细胞增殖，RT—PCR检测黄芪皂苷I对IL—2、IFN—γ和T—bet mRNA基因表达。
结果黄芪皂苷I 在30nM显著促进ConA 刺激T淋巴细胞增殖，差异有显著性意义（P毕业论文网 关键词：黄芪皂苷I；T淋巴细胞；Th1免疫反应；IFN—γ；T—bet 中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007—2349（2017）12—0072—03 【Abstract】Objective： To study the immunomodulatory effect of stragaloside I and its molecular mechanism. Methods： The splenic lymphocyte proliferation model induced by mitogen was established to determine the response of astragaloside I to T lymphocytes proliferation induced by ConA and B lymphocytes proliferation induced by LPS. T lymphocyte proliferation induced by anti—CD3 mAb antibody was established. RT—PCR was used to determine astragaloside I to the genetic expression of IL—2， IFN—γ and T—bet mRNA. Results： Astragaloside I significantly promoted the proliferation of T lymphocyte stimulated by ConA at 30 nM， and the difference was significant （P医学院左爱学博士提供，受试药物呈白色粉末状，纯度>99%，用DMSO作为溶剂配置成5 mg/mL储存液，—20℃保存备用，临用前用RPMI—1640培养液稀释成相应浓度；RPMI—1640培养基购自GibcoBRL公司（life Technologies，Grandisland，NY，USA）；胎牛血清（fetal bovine serum）购自Hyclone 公司（Logan，Utah，USA）；刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）购自Sigma公司（St.Louis.MO，USA）；Trizol裂解液购置天根生化（北京）科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.3主要仪器离心机购自德国Thermo Scientific Heraeus；二氧化碳培养箱和生物安全柜均购自美国Thermo—fisher；Epoch连续波长酶标仪购自美国Bio—Tek公司。
2实验方法及评价 2.1脾淋巴细胞的制备小鼠脱脊椎处死，无菌取其脾脏。
将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于1200 rpm离心5 min。
弃去上清，沉淀加入红细胞裂解液（每个脾脏约1 mL），混匀，静置1分钟，加入PBS，离心。
再加入PBS，过膜，离心。
将所剩细胞洗涤1～2次后，用含10%FBS的RPMI—1640将细胞调至所需浓度。
2.2MTT法测定丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能小鼠脾脏淋巴细胞（4×105个/孔）接种于96孔板，加入不同浓度的受试物，同时加入ConA（终浓度1μg/ml）或LPS（终浓度10μg/ml），另设无刺激剂的本底对照。
于37℃，5% CO2培养箱中作用48h，MTT法检测丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能。
2.3RT—PCR检测IL—2、IFN—γ和T—bet mRNA基因表达因表达，用序列单环己基铵ed ymmunomodulatin—脾淋巴细胞（5×106个/孔）接种于anti—CD3 mAb抗体（5μg/ml）包被的24孔板中，加入黄芪皂苷II（30nM），另设相应溶媒对照和无刺激本底对照，于37℃，5% CO2培养箱培养16h后，收集细胞，Trizol一步抽提法提取总RNA，反转成cDNA，PCR检测检测IL—2、IFN—γ和T—bet mRNA基因表达，电泳和成像。
特异基因引物序列如下： 基因PCR引物序列IL—2：（sense）5’—TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG—3’；（anti—sense）5’—GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC—3’；IFN—γ：（sense）5’—ATGAACGCTACACACTGCATC—3’；（anti—sense）5’—CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC—3’；T—bet：（sense）5’—CCAGGAAGTTTCATTTGGGAAGC—3’；（anti—sense）5’—ACGTGTTTAGAAGCACTG—3’；β—actin：（sense）5’—GGCTGTATTCCCCTCCATCG—3’；（anti—sense）5’—CCAGTTGGTAACAATGCCATGT—3’；2.3统计学分析所有实验数据均采用统计学方法处理。
均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析，数据统计均以平均值±标准差表示，以P0.05）。
3.2黄芪皂苷I对IL—2、IFN—γ和T—bet mRNA基因表达的影响见图2。
RT—PCR方法检测黄芪皂苷 II对IL—2、IFN—γ和T—bet mRNA表达情况。
结果显示，anti—CD3 mAb刺激16h后能够显著诱导IL—2、IFN—γ和T—bet mRNA表达，黄芪皂苷 I体外用药能够显著上调IFN—γ和T—bet的mRNA表达，而对IL—2表达水平无明显影响，说明黄芪皂苷I 在基因转录水平可能通过促进T—bet的转录而诱导IFN—γ的表达。
4讨论 在机体的细胞免疫中T细胞发挥着重要的作用，T淋巴细胞不仅是细胞免疫功能的承担者，而且也是免疫应答的调节者，其中以辅助性T淋巴细胞（Th）和抑制性T 淋巴细胞（Ts）对免疫网络的调节作用至为重要，参与多种自身免疫性疾病和肿瘤免疫过程。
IFN—γ是Th1型细胞释放的重要的细胞因子，对Th1细胞的分化起着重要作用，同时其可诱导巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的产生，促进NO的合成，是IFN—γ抗肿瘤作用重要的分子机制之一[6—7]。
T 细胞激活后分化发展成为Th1、Th2、Th17和Treg等T淋巴细胞亚群受到不同转录因子的调节。
T—bet属于T—box家族的转录因子，选择性表达于Th1细胞，作为Th1特异的转录因子能诱导Th1型细胞因子的产生，在Th1细胞的分化中起着决定作用[8]。
T细胞激活后产生两种重要的细胞因子IL—2、IFN—γ，它们对促进和扩大免疫反应有很强的功能。
IL—2是T细胞增殖所必需的T细胞生长因子，具有很强的免疫刺激作用和抗肿瘤活性[9]。
我们的实验结果表明，黄芪皂苷I显著促进anti—CD3 mAb诱导的T淋巴细胞增殖。
在mRNA水平上，黄芪皂苷 I 也能够显著上调 IFN—γ、T—bet 的mRNA表达水平。
研究已证实，黄芪皂苷能够显著激活 CD45 PTPase 酶活性。
在分子水平，黄芪皂苷能够显著促进CD45 PTPase作用底物P56LCK（Tyr505）去磷酸化。
基于以上实验结果，推测黄芪皂苷 I作为CD45 PTPase激活剂，在细胞水平可能通过激活CD45 PTPase，参与TCR介导的T淋巴细胞信号转导，从而激活下游相关信号通路，引起Th1特异性转录因子T—bet转录激活，促进T 淋巴细胞增殖和IL—2、IFN—γ的产生。
该研究丰富和发展黄芪“健脾补中，益卫固表”功效的科学内涵，为传统中药的现代研究提供新的研究思路和方法。
参考文献： [1]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986：2038. [2]Chun—Ping Wan，Li—Xin Gao，Li—Fei Hou，et al.Astragaloside triggers T cell activation through regulating the activity of CD45 protein tyrosine phosphatase[J].Acta Pharmacologica Sinica，2013，（34）：522—530. [3]万春平.黄芪皂苷类组分生物活性研究进展[J].云南中医中药杂志.2011，32（8）：79—81. [4]万春平.黄芪皂苷III通过IFN—γ介导体外免疫调节作用的研究[J].云南中医中药杂志.2011，32（9）：69—71. [5]Wang YP，Li XY，Song CQ，et al.Effect of astragaloside IV on T，B Lymphpcyteproliferation and peritoneal macrophage function in mice[J].Acta Pharmacol Sin.2002，（3），263—266. [6]Susanne J.Szabo，Brandon M.Sullivan，Stanford L.PengAnnu.Rev.molecul ar mechansism regulating Th1 immune responses.Immunol.2003，21：713—58. [7]金伯泉.细胞和分子生物学[M].北京：科学出版社，2001：185—186. [8]Ansel KM，Lee DU，Rao A.An epigenetic View of helper T cell differation[J].Nat Immunol.2003，（4）：616—23. [9]Tomas Mustelin，Souad Rahmouni，Nunzio Bottini.et al.Role of protein tyro sine phosphatases in T cell activation[J].Immunological Reviews，2003，（191）：13 9—147. （收稿日期：2017—11—10）。