微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新
【关键词】; ,微生物次级代谢产物；,,生物合成基因簇；,,药物创新；,,组合生物合成；,,代谢工程。
摘要：; 微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。迄今为止已有超过150种生物合成基因簇通过各种方式被克隆，并被用于组合生物合成、体外糖类随机化、代谢工程的定向改造。我们研究室已经克隆并测定了氨基糖苷类井冈霉素/有效霉素、多烯类抗生素FR008/克念菌素、聚醚类南昌霉素、聚酮类梅岭霉素、杂合聚酮多肽类口恶唑霉素等生物合成基因簇。深入的基因功能分析揭示了他们独特的生物合成途径和调节机理，为正在进行的组合生物合成结构改造和代谢工程产量提高奠定了基础。
关键词：; 微生物次级代谢产物；; 生物合成基因簇；; 药物创新；; 组合生物合成；; 代谢工程。
Secondary metabolic pathway genes and new drug discovery。
ABSTRACT; Microorganisms produce myriads of secondary metabolites with both structural and functional diversities. The cloning of corresponding biosynthetic gene clusters is essential for new drug discovery and yield improvement by metabolic engineering. To date, more than 150 biosynthetic gene clusters had been cloned via different strategies, which are subsequently manipulated through combinatorial biosynthesis, in vitro glycorandomization, or other biotechnological methods. In our laboratory, several biosynthetic gene clusters have been cloned and sequenced, representatives of which are responsible for the biosyntheses of the aminoglycoside jinggangmycin/validamycin, polyene antibiotic FR008/candicidin, polyether nanchangmycin, polyketide meilingmycin, PKSNRPS oxazomycin and others. Extensive analyses of gene functions, their unique biosynthetic pathways and regulatory mechanisms have now paved the way for more rational structural modifications through combinatorial biosynthesis and yield improvements using metabolic engineering.
KEY WORDS; Microbial secondary metabolites Biosynthetic gene cluster New drug discovery Combinatorial biosynthesis Metabolic engineering。
微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。根据结构特点可以基本上将抗生素分为β内酰胺、氨基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类。以上多种多样抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用。随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高。另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)［1］和代谢工程(metabolic engineering)［2］成为解决上述问题的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提。
1.1; 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida等1984年克隆了放线紫红素的全部生物合成基因［3］，以及随后克隆的榴菌素［4］、红霉素［5，6］、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。除此之外，微生物次级代谢产物生物合成基因簇还具有以下几个特点：①生物合成基因一般形成几个不同的转录单位；②通常含有一个以上的耐药性基因，且耐药性基因和结构基因表达之间有一定的相互调节；③绝大多数基因表达的调控发生在转录水平，除了受特异的途径专一性调节因子调控外，还受到同时影响胞内其他产物合成甚至细胞分化的全局性调节因子的调控［7］。微生物次级代谢产物生物合成基因的成簇排列特征为相应生物合成基因的克隆提供了方便，也就是说，几乎任何一个结构基因、耐药性基因、转运蛋白基因或途径专一性调节基因的克隆都有可能导致整个生物合成基因簇的获得。
1.2; 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的克隆情况根据微生物次级代谢产物生物合成基因簇的上述特点，大量的生物合成基因簇从不同的微生物种群中克隆出来，其中主要的克隆方法有突变株回补(如放线紫红素［3］)、利用同源性较高的异源DNA作为探针的杂交法(如榴菌素［4］)、耐药性基因的克隆(如红霉素［5］)、从蛋白质分离到反推编码DNA的反向遗传(如利福霉素［8］)、根据同源蛋白保守区设计的兼并性引物扩增法(如阿卡波糖［9］)以及整个生物合成基因簇的异源表达(如肠球菌素［10］)等。通过上述克隆方法，迄今为止已经克隆了超过150种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇，一方面进一步证明了微生物次级代谢产物成簇排列的特点，另一方面也揭示了结构上不同的代谢产物在编码基因上的相关性，例如β内酰胺类、多肽类、糖肽类都主要由非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)［11］负责合成，四环素类、大环内酯类、安莎类、聚醚类则由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)［1］合成。因此根据编码基因种类的不同，所有已克隆的生物合成基因簇可以按表1中所列的类别来归类。
1.3; 次级代谢产物生物合成基因簇资源的定向利用如此众多生物合成基因簇的克隆为微生物次级代谢产物的比较研究打下了坚实的基础。1985年Hopwood等将放线紫红素的生物合成基因转入榴菌素和麦德霉素产生菌获得杂合抗生素［12］，标志着微生物次级代谢产物组合生物合成技术的诞生，即通过将不同次级代谢产物合成基因在微生物间的相互交换产生非天然的基因组合，从而人为定向设计具有新结构的次级代谢产物的遗传操作过程。迄今为止，组合生物合成的理论基础和技术储备已经相当丰富，并且产生了数百种非天然的“天然产物”(nonnatural natural product)。2001年Thorson教授首先提出了将化学合成和酶催化进行有机结合的体外糖类随机化(in vitro glycorandomization，IVG)［13］的新概念，即把通过化学方法高效合成的多种自由糖基，在定向进化产生的具有底物识别广谱性糖基激酶、核苷转移酶和糖基转移酶的级联催化下，在体外转移到多种糖基受体，从而大量产生多种新结构、新活性衍生物的过程。他们利用万古霉素的糖基转移酶GtfE和许多非天然的NDP糖基供体一次性获得了32种携带有不同糖基的万古霉素衍生物，充分显示了该项技术的高效性和巨大潜力。微生物次级代谢产物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途径及生物合成调控机理的阐明成为可能，从而揭示生物合成途径的限速步骤和调控节点，并进行相应的遗传操作来显著提高次级代谢产物的产量或提高活性组分的比例、降低消除低活性组分的含量。因此在基因簇克隆和遗传分析基础上的代谢工程研究也变得目的性更强、效率更高。例如，Malmberg等在利用棒状链霉菌研究头霉素C的生物合成过程中发现，控制从初级代谢产物赖氨酸向头霉素前体α氨基己二酸转化的赖氨酸ε氨基转移酶(LAT)是头霉素C生物合成的限速酶，额外拷贝LAT向棒状链霉菌的引入致使头孢霉素C的产量提高了2～5倍［14］。
2; 上海交通大学分子微生物学实验室的研究进展。
我们实验室长期从事重要的农业、饲养业抗生素生物合成的研究，包括抗水稻纹枯病的井冈霉素和5102I号素、抗稻瘟病的庆丰霉素、抗玉米小斑病的5102II号素和静丝霉素、 广谱抗真菌多抗霉素、 抗鸡球虫病的南昌霉素、广谱杀虫活性的梅岭霉素等。近年来我们也在抗真菌抗生素FR008/克念菌素、抗肿瘤和HIV口恶唑霉素、抗肿瘤安丝霉素的生物合成方面进行了深入研究。 ;。
2.1; 井冈霉素/5102I的生物合成氨基糖苷类井冈霉素是由吸水链霉菌井冈变种5008产生的重要农用抗生素，是我国乃至东南亚防治水稻纹枯病的重要药物，年产量已经超过4万吨。井冈霉素和有效霉素(validamycin)的结构一致，即结合有一分子葡萄糖基的井冈胺/有效氧胺(validoxylamine)。井冈霉素的大面积使用使提高其产量(尤其是活性组分A组分的含量)，降低生产成本具有重要的意义。井冈霉素也是生产临床上重要的治疗糖尿病药物伏格列波糖(vogliobose)和阿卡波糖的重要前体，其产量的提高和特异合成中间体的积累将显著降低生产成本或简化生产工艺。井冈霉素和阿卡波糖同属于C7N氨基环醇类次级代谢产物，前期的化学喂养实验证实由7磷酸景天庚酮糖环化而成的2表5表有效醇酮是两者生物合成途径中共同的前体物，因此推断催化该步反应的环化酶基因应该有较高同源性［15］。利用来自于游动放线菌SE50/110阿卡波糖生物合成基因簇的环化酶基因acbC为异源探针，我们在井冈变种5008的基因文库中钓取了覆盖约70kb染色体区域的阳性克隆，随后该区域内30kb大片段的缺失导致突变株丧失了合成井冈霉素的能力，直接证明了该区域同井冈霉素的生物合成直接相关［16］。对acbC同源环化酶基因valA两侧45kb区域的序列测定揭示了27个开放阅读框(open reading frame,ORF)(白林泉等，待发表)，其中包括16个结构基因，2个调节基因，1个转运蛋白基因，3个与转座有关的基因，1个抗碲基因和其他4个未知基因(图1)。通过基因的逐个敲除与回补我们确定了与井冈霉素A组分合成直接相关的8个结构基因(valA, B,C,K,L,M,N,G)，而且这8个基因重新组装后在变铅青链霉菌1326中的异源表达也产生了井冈胺A和井冈霉素A。同时我们正在通过异源表达各个相关合成酶并进行相关的体外催化活性分析。一方面直接证明了环化酶ValA能够环化7磷酸景天庚酮糖生成2表5表有效醇酮，另一方面糖基转移酶ValG催化一分子的葡萄糖转移到井冈胺上从而生成最终产物井冈霉素A，而且UDP葡萄糖是最佳的糖基供体。而对激酶ValC的体外催化分析发现井冈霉素生物合成的中间产物有效烯酮和有效酮为最适底物， 明显不同于阿卡泊糖生物合成基因簇种的同源蛋白AcbM的功能，AcbM催化2表5表有效醇酮的磷酸化(章亦荣等，待发表)。井冈霉素生物合成基因簇的克隆、序列测定和初步功能分析为其生物合成途径的最终阐明奠定了基础，同时调节基因和转运蛋白编码基因的发现也为井冈霉素产量的提高提供了最理想的改造靶点。另外初步分析显示，8个必需基因之外的其他结构基因很可能与井冈霉素其他组分的合成相关，因此这些基因功能的阐明有利于消除各种次级组分的积累、显著提高活性组分井冈霉素A的积累。最近我们在吸水链霉菌应城变种1022中克隆和测定了5102I号素的生物合成基因簇。与井冈霉素生物合成基因簇相比，5102I号素的生物合成基因簇中结构基因的排列发生了很大变化，而且也缺少相应的调节基因，这可能是5102I号素产量很低的原因(蹇晓红等，待发表)。两个相似抗生素生物合成基因簇的克隆为该类次级代谢产物的比较研究和定向改造提供了良好素材。实现井冈霉素在水稻等植物中的表达、直接抵抗水稻纹枯病等真菌病害的侵染也是本项研究的目标之一，相关工作正在开展,跨学科的合作研究也在酝酿之中。
2.2; 抗生素FR008/克念菌素的生物合成38元七烯大环内酯类聚酮化合物抗生素FR008是由链霉菌FR008产生的，结构上同克念菌素(candicidin)一致，具有抗真菌和杀灭蚊子幼虫的活性，临床上多用于念球菌阴道炎的治疗，还可通过降低胆固醇，减轻前列腺增生症。因为抗生素FR008结构中带有来自于对氨基苯甲酸的对氨基苯乙酮成色基团，所以我们利用来自于克念菌素产生菌灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶为异源探针，在国际上首次克隆了多烯类聚酮化合物的生物合成基因簇，即抗生素FR008的生物合成基因簇，并通过基因中断实验证实该区域跨越150kb以上［17］。最终对总共1498kb区域的序列测定揭示了21个可能的相关基因(图2)［18］，其中有6个基因编码巨大的成模块组织(modular)的聚酮合酶fscAF，共编码21个模块，这与抗生素FR008骨架合成所需的21步缩合反应是非常一致的，而且在结构域水平上揭示了七烯共轭结构形成了分子基础。基因簇序列分析还发现了与起始单位对氨基苯甲酸合成相关的基因(pabAB和pabC)、与海藻糖胺(mycosamine)糖基合成相关的基因(fscMII和fscMIII)、与糖基化和羧化等后修饰反应相关的基因(fscMI、fscP和fscO)。同时还发现了四个调节基因和两个转运蛋白，有利于提高抗生素FR008的产量。根据对抗生素FR008生物合成基因簇的生物信息学分析，我们提出了抗生素FR008复合物中四种主要组分的分子转换模式［18］，最新的研究成果表明这种推断是正确的，而且获得了只积累主要活性组分II号组分的工程菌株(周永军等，待发表)。通过对糖基转移酶基因的失活获得了一系列缺失了糖基的新衍生物，并可以初步推断出糖基的转移发生在羧化反应之后，是后修饰反应的最后一步。而对海藻糖胺合成相关的转氨酶基因fscMII的敲除获得了糖基上缺少氨基的一系列衍生物，显示了糖基转移酶FscMI相对的底物广谱性。