海带褐藻糖胶磺化工艺研究
作者：王晶 张忠山 张全斌，胡如桂，綦慧敏 李智恩 徐祖洪。
【摘要】 目的优选海带褐藻糖胶(FPS)磺化的工艺。方法以氯磺酸－N, N—二甲基甲酰胺(DMF)为磺化试剂，采用正交设计法, 考察反应时间、反应温度及磺化剂用量对海带褐藻糖胶磺化反应的影响, 找出制备高硫酸根含量海带褐藻糖胶的最佳方法。结果反应时间和反应温度对海带褐藻糖胶的磺化有显著影响(0.01。
Abstract:ObjectiveTo explore the optimum method for preparation of sulfated fucoidan extracted from Laminaria japonica. MethodsUsing chlorsulfonic acid and DMF as sulfated reagent, test the effect of reaction time, reaction temperature and volumn of sulfated reagent by the orthogonal design method. Results Reaction time and reaction temperature were the significant factors (0.01。
硫酸酯化多糖又称多糖硫酸酯，是多糖的衍生物。近年来研究表明,多糖经硫酸化后,本身富含硫酸根,易与蛋白质的特定结构域结合,由此改变其构像并影响其功能,使其具有多种生物活性,如增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等,特别是抗艾滋病病毒（HIV）活性引起许多研究者的极大兴趣，使硫酸酯化多糖的研究成为多糖研究领域内的一个新热点［1］。 褐藻糖胶又称褐藻多糖硫酸酯,是一种含有硫酸基的阴离子杂聚糖,一般存在于褐藻和一些棘皮动物体中,具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡等独特的生物活性,近年来成为海洋药物的研究热点之一［2，3］。研究表明硫酸根的含量与生物活性有密切的关系。Satoru K等［4］研究了从墨角藻中提取的褐藻糖胶的抗肿瘤活性,结果表明过硫酸化的褐藻糖胶的抗肿瘤活性显著高于原料褐藻糖胶。以氯磺酸－吡啶为磺化试剂制得的褐藻糖胶的过硫酸化产物的抗凝血活性是原料的4倍［5］。从褐藻海黍子中提取的褐藻糖胶, 磺化后, 其高硫酸根组分对L－1210白血病有效果［6］。Haroun—Bouhedja F 等［7］研究了从泡叶藻中提取的褐藻糖胶的生物活性,发现双硫取代的样品对抗凝血活性贡献较大,当硫酸根与褐藻糖的比值大于1.5时,抗凝血活性效果较好。 海带Laminaria japonica是褐藻门海带目海带属的一种大型海藻,含有丰富的蛋白质、纤维素和矿物质,是一种经济价值很高的天然保健食品。从海带中提取出的褐藻糖胶也有许多独特的生物活性。我们前期的研究工作表明提高硫酸根的含量可以提高其体外抗氧化能力。因此本实验就海带褐藻糖胶的磺化反应进行了研究,考察了反应时间、反应温度及磺化剂用量对产物硫酸根含量的影响,从而优化海带褐藻糖胶的磺化工艺。
1 材料与仪器。
1.1 样品。
干海带,购于青岛沙子口。
1.2 试剂。
甲酰胺 (AR)；N,N－二甲基甲酰胺（DMF）(AR)；氯磺酸 (AR)；95%乙醇；浓盐酸 (AR)；明胶 (AR) ；氯化钡 (AR)；氯化钾 (AR)；氯化镁 (AR)。
1.3 仪器。
高压锅（山东新华医疗器械股份有限公司）；FA1004电子天平（上海天平仪器厂）；722型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；瑞士BüCHI R－114型旋转蒸发仪；东京理化EYELA FD－5N型真空冷冻干燥机；电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；TDL－40B离心机（上海飞鸽系列离心机厂）。
2 方法。
2.1 海带褐藻糖胶（FPS）的提取将干海带用自来水清洗,除去泥沙,烘干,塑料袋封口室温下保存。取上述干海带100 g ,粉碎,用20倍蒸馏水在高压锅中提取3 h,过滤,滤液加0.05 mol/L 氯化镁和20%的乙醇沉淀,硅藻土过滤,加活性炭在沸水浴中脱色30 min,硅藻土过滤,滤液中加0.1%KCl和75%乙醇沉淀,离心,将沉淀在红外灯下烘干即得褐藻糖胶 (FPS)［8］。
2.2 海带褐藻糖胶磺化方案设计 反应时间、反应温度和磺化剂用量作为考察因素,每个因素拟定3个水平（见表1）,选用L9（34）正交表进行实验。表1 正交实验因素水平（略）。
2.3.1 磺化试剂SO3－DMF的制备在冰浴中将50 ml 氯磺酸缓慢滴加到300 ml N,N－二甲基甲酰胺（DMF）中，滴加完毕后室温搅拌30 min，倒入棕色瓶中闭光保存。
2.3.2 磺化反应称取干燥的海带褐藻糖胶样品2 g，倒入干燥的250 ml三口瓶中，加入80 ml甲酰胺，不同反应温度下机械搅拌30 min，滴加不同剂量的磺化试剂SO3－DMF，反应指定时间。反应完毕后, 将反应液倒出，在0.1%KCl存在下, 用75%乙醇沉淀, 并用95%乙醇洗涤沉淀2～3次，将沉淀在红外灯下烘干，溶于100～150 ml蒸馏水中，用2 mol/L NaOH 中和到pH为7.0～8.0，3 600 Da透析袋透析，自来水透析2 d，蒸馏水透析1 d。旋转蒸发至100 ml，真空冻干［9］。