芪蛭益肺颗粒对COPD大鼠模型SPA表达和超微结构的影响
作者：李金田 张莉 刘永琦 李娟 张毅 魏舒。
【摘要】 目的 探讨芪蛭益肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型肺表面活性物质相关蛋白A(SPA)表达及肺组织超微结构的影响。方法 运用气管内滴注脂多糖加烟熏28 d法建立COPD大鼠模型，免疫组化法检测SPA表达及透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构变化。结果 与空白组比较，模型组大鼠SPA表达明显减少，有显著差异(P0.01)，肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构不完整;与模型组比较，芪蛭益肺颗粒治疗组大鼠SPA表达明显增强，差异显著(P0.01)，肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构完整。结论 芪蛭益肺颗粒可显著提高模型大鼠SPA表达，改善细胞超微结构，对COPD的发生起到预防保护作用。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和﹙或)肺气肿 ，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关〔1〕。据世界卫生组织预计，至2020年COPD将成为世界疾病经济负担的第五位〔2〕。在我国，在老年人易患疾病中，慢性支气管炎与肺气肿居第三位，而病死率为第一位〔3〕，对老年人健康生命的威胁越来越严重，因此COPD的预防和治疗已成为国内外学者研究的热点问题之一。本课题通过实验研究观察了纯中药制剂芪蛭益肺颗粒对COPD的疗效及其对肺组织表面活性物质相关蛋白(SPA)表达和超微结构的影响作用，为其在COPD临床治疗中的广泛应用提供理论依据。
1 材料与方法。
1.1 动物 选取SPF级健康Wistar大鼠60只，体重(200±20)g，雌雄各半﹙由甘肃中医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK(甘)20040006)。
1.2 药物 芪蛭益肺颗粒﹙由黄芪、水蛭、党参等药物组成﹚浓缩煎液，由甘肃中医学院药物制剂室煎制;固本咳喘片，浙江台州南峰药业生产，批号：070504。
1.3 主要试剂及仪器 脂多糖(LPS，10 mg，美国Sigma公司,批号：L2880);兰州牌香烟(焦油量12 mg，烟气烟碱量0.8 mg，烟气一氧化碳量13 mg，甘肃烟草工业有限责任公司);SPA检测试剂盒﹙武汉博士德生物工程有限公司，批号：030209);有机玻璃熏箱48 L(20 cm×40 cm×60 cm，自制);MiE显微图像处理软件一套﹙成都泰盟科技有限公司﹚;ES1000E型电子称一台﹙长沙湘平科技发展有限公司﹚;JEM1230型透射电镜一台﹙日本JEOL﹚。
1.4 动物分组及模型制备 大鼠常规饲养1 w后，随机分为：空白组、模型组、阳性药物对照组、芪蛭益肺颗粒大剂量治疗组、中剂量治疗组、小剂量治疗组，每组10只,雌雄各半。COPD大鼠模型制备参考文献〔4〕，采用气管内滴注LPS加烟熏28 d的方法。除空白组外，其余各组第1、14 天气管内滴注LPS(0.1 mg/100 g)，第2～13天，第15～28天，每日上午在容积为48 L玻璃密闭箱内持续熏兰州牌香烟雾30 min，每天1次，1支/只。每次熏烟后，将大鼠置于鼠笼内常规饲养。
1.5 给药方法 第15天空白组等体积生理盐水﹙2 ml/只)灌胃，阳性药物对照组给予固本咳喘片药液(0.324 g/kg)灌胃，芪蛭益肺颗粒大剂量(3.6 g/kg)、中剂量(1.8 g/kg)、小剂量治疗组(0.9 g/kg)均给予芪蛭益肺颗粒药液灌胃治疗。每日上午 1 次，干预治疗28 d，即大鼠共饲养42 d。
1.6 标本采集及检测。
1.6.1 大鼠一般状态观察 观察各组大鼠一般状态﹙活动度、精神状态、皮毛光泽度、饮食情况、体重增幅﹚及大鼠咳嗽、气喘、鼻及呼吸道分泌物等症状并做记录。
1.6.2 各组大鼠肺组织SPA表达检测 各组大鼠用20%乌拉坦溶液1.0 g/kg腹腔内注射麻醉，取右肺下叶，置于10%中性甲醛固定液内固定48 h，常规石蜡包埋、切片,应用免疫组化法检测SPA表达，每张切片在同一放大倍数下随机选取3个视野，计数平均肺泡阳性细胞数(个∕肺泡)。
1.6.3 超微结构观察 取各组大鼠左肺下叶由脏层胸膜表面指向肺门方向的肺组织，切取截面约2 mm×1 mm肺组织条，放置在滴有戊二醛的硬纸板上，然后再从各条块切取大约1 mm×1 mm×1 mm大小的肺组织块，经预冷的2.5%戊二醛于4℃环境下固定24 h，再用1%锇酸后固定1 h，梯度乙醇和丙酮脱水，EPon812包埋，制成超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅双重染色后，透射电镜观察。
1.7 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件处理，实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析。