长春新碱诱导肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素与bcl2的变化
【摘要】 目的 探讨长春新碱(VCR)诱导HepG2肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素表达的变化及阻断泛素蛋白酶体通路对此凋亡和bcl2表达的影响。方法 应用VCR诱导HepG2细胞自噬性凋亡，采用流式细胞仪检测凋亡及泛素的表达；以RTPCR检测bcl2的表达。结果 VCR处理后发生自噬性凋亡的HepG2细胞中泛素含量增加（P0.01）。加用蛋白酶体特异抑制剂乳胞素后的乳胞素+VCR组凋亡率明显比单用VCR组高（P0.01），而bcl2表达则比单用VCR组更低。结论 泛素蛋白酶体通路参与了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡及对bcl2蛋白的调控。对蛋白酶体功能的抑制可以促进VCR诱导的HepG2细胞凋亡。
【关键词】 长春新碱；泛素蛋白酶体通路；肝癌细胞；凋亡；bcl2。
Key words：Vincristine;Ubiquitinproteasome pathway;Hepatoma cell;Apoptosis; bcl2。
新近的研究显示泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasome pathway，简称泛素通路）是细胞凋亡调控的主要机制之一，这种机制可能是肿瘤等疾病治疗的一个独特靶点，有关研究认为泛素通路参与凋亡的调控是通过对bcl2蛋白的调节而发挥作用的[1]。长春新碱（vincristine,VCR）是一种常用的抗癌药物。本研究中，作者先用VCR诱导了人肝癌细胞系HepG2细胞自噬性凋亡，在此凋亡模型[2]基础上，特定研究了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程中泛素通路及bcl2表达的有关变化。
1 材料与方法。
1.1 细胞及培养。
人肝癌细胞系HepG2细胞（购自上海中科院细胞所）用含10%小牛血清的RPMI1640培养液(Gibco BRL公司)培养。
1.2 细胞分组与加药处理。
未加药对照组仅加等体积生理盐水。VCR处理组的药物处理基本同文献[2]（VCR为sigma公司产品），即于培养液中加入1μg/mL的VCR去诱导。在药物作用不同时间后用0.125%胰蛋白酶EDTA消化收获细胞行以下实验。
分别将对照组、VCR作用4h组、VCR作用16h组的HepG2细胞经固定、漂洗后加1∶200的抗泛素(博士德公司)，4℃过夜，加1∶64的IgGFITC(Sigma产品)于室温作用30分钟后用Elite流式细胞仪(COULTER公司)分别检测各组平均荧光强度。
1.4.1 被检测细胞分三组：对照组、VCR 16h组、乳胞素+VCR 16h组。乳胞素(Lactacystin，CALBIOCHEM公司)为蛋白酶体的抑制剂，使用浓度为10μM[3]，细胞加用乳胞素8h后再加用VCR处理16h。
1.4.2 用Goldkey软件设计bcl2引物，由上海生物工程公司分别合成，bcl2扩增引物为sense: 5′GGACAACATCGCCCTGTG3′(551～568); antisense: 5′AGTCTTCAGAGAACAGCCAGGA3′(668～688), 扩增片段为137bp；内参照GAPDH扩增引物为sense: 5′GGTGAAGGTCGGTGTCAACG 3′；antisense: 5′caaagttgtcatgcatgacc 3′，扩增片段为496 bp。
1.4.3 RNA分离用Trizol reagent总RNA分离试剂盒(Gibco公司)从细胞中提取细胞RNA。
1.4.4 cDNA合成用THERMOSCRIPT RTPCR System试剂盒（Gibco公司）将分离的RNA逆转录成cDNA。
1.4.5 PCR以此cDNA为模板行扩增反应。RTPCR反应体系：模板20μL,上游引物（10μmol/L）和下游引物(10μmol/L)各2μL，dNTP4μL(10mmol/L)，10×Taq多聚酶缓冲液10μL，TaqDNA聚合酶1μL(5u)。PCR循环参数为94℃，1.5min；52℃，1.5min；72℃，2.5min;44个循环后72℃，20min。
1.4.6 取PCR产物行电泳分析(电泳仪、电泳槽为BioRad公司产品)。以X174Hinc II digest DNA Marker(TaKaRa Biotech)为分子量参照。
分别检测对照组、VCR 4h组、VCR 16h组、乳胞素+VCR 16h组的细胞凋亡率：约1×106个各组细胞经固定、漂洗后加1%RNase37℃作用30分钟，随后分别加入PI(50μg/ml)避光染色；流式细胞仪测定DNA含量。低于G1期二倍体DNA含量的细胞为凋亡细胞。各组均测定10 000个细胞，由流式细胞仪计算平均凋亡百分率，统计处理采用χ2检验。