罗格列酮对人乳腺癌MDAMB231细胞的体外抗肿瘤作用

作者：章涛 余华荣 杨贵忠 刘颖菊 杨俊卿 蒋建新 周岐新 论文代写。

【摘要】 　　目的： 研究 过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂罗格列酮对人乳腺癌细胞MDAMB231体外生长 影响 ，以评价其在人乳腺癌 治疗 上的 应用 潜力. 方法 ：噻唑蓝(MTT)法检测罗格列酮对MDAMB231细胞体外生长抑制作用；应用PPARγ拮抗剂GW9662， 分析 罗格列酮对MDAMB231细胞增殖影响与PPARγ受体关系；流式细胞仪分析细胞周期，Annexin VFITC和TUNEL法检测细胞凋亡. 结果：罗格列酮干预下MDAMB231细胞G0/G1期比例上升，而S期比例下降，呈量效关系抑制其生长，IC50=5.2 μmol/L. PPARγ拮抗剂GW9662可部分逆转罗格列酮对MDAMB231细胞增殖抑制作用（P0.05）；100 μmol/L罗格列酮还可诱导MDAMB231细胞凋亡，TUNEL法检测的凋亡率(18.4±3.1)%与Annexin VFITC法检测的结果一致［(16.6±2.7)%］（P0.05）. 结论：罗格列酮通过PPARγ介导，使MDAMB231细胞G1期阻滞而抑制其增殖，高浓度时还可诱导其发生凋亡，罗格列酮有望成为治疗乳腺癌的有效药物.

【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 罗格列酮 抗肿瘤药 乳腺肿瘤 MDAMB231细胞 毕业论文。

0引言 毕业论文。

由罗格列酮、吡格列酮和环格列酮等组成的噻唑烷二酮类（thiazolidinedione，TZD）人工合成过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ)激动剂已被广泛应用于糖尿病的临床治疗当中［1］.近年来的研究显示，TZD等PPARγ激动剂可抑制多种肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，激活PPARγ受体极有希望成为治疗多种恶性肿瘤的新途径［2］.但 目前 为止，尚无罗格列酮对人MDAMB231乳腺癌细胞体外抗肿瘤的系统研究报道.鉴于此，我们就细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等方面探讨罗格列酮对MDAMB231细胞的体外生物学效应，为未来临床抗肿瘤应用提供 理论 依据. 论文代写。

1材料和方法 论文网。

1.1材料MDAMB231人乳腺癌细胞株购自中科院上海细胞库.罗格列酮购自重庆康尔威药业公司（批号:20051，纯度0.99）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、PPARγ受体拮抗剂GW9662购自Sigma公司； TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京凯基生物；Annexin VFITC Kit为Beckman Coulter公司产品；RPMI1640培养基、小牛血清购自HyClone公司；其它试剂均为分析纯. Coulter counter细胞计数仪（Beckman Coulter 公司）；Safire全波长酶标仪（TECAN 公司）；FACS Calibur流式细胞仪（BectonDickinson公司）.由于罗格列酮和GW9662难溶于水，用DMSO制成0.1 mol/L的母液，—20℃冰箱保存备用. 论文代写。

1.2方法。

1.2.1细胞培养MDAMB231细胞培养于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，常规加入青霉素（105 U/L）与链霉素（100 mg/L），于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养.

论文代写。

1.2.2MTT检测细胞增殖抑制率取对数生长期的MDAMB231细胞，计数并调整密度为1.2×108/L，以每孔100 μL接种于96孔板中培养，15 h后更换培养基，设置对照组和不同浓度药物组（罗格列酮1×10—8，1×10—7，1×10—6，1×10—5，1×10—4 mol/L），每组设8个复孔.继续培养24 h后，加入10 μL MTT（5 g/L），继续孵育4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min待结晶溶解，于酶标仪上测定570 nm波长的A值， 计算 不同浓度罗格列酮对MDAMB231细胞的生长抑制率：细胞抑制率（%）=［1－试验组A570 nm/对照组A570 nm］×100％.将药物浓度的对数值和抑制率拟合后计算出IC50.试验重复3次. 毕业论文。

1.2.3细胞增殖能力检测取对数生长期细胞，细胞计数并调整密度为5×107/ L，以每孔1 mL接种于6孔板中培养.第2日更换含不同药物组合的新鲜培养基，包括1 mL/L DMSO, 1 μmol/L罗格列酮、5 μmol/L GW9662以及1 μmol/L 罗格列酮与5 μmol/L GW9662联用共4个组，每48 h更换含相应药物的新鲜培养基.分别于用药后第2，4，6日收集细胞计数，每组计3个复孔，求其平均值.试验重复3次.

1.2.4细胞周期分析取对数生长期细胞，调整密度为3×108/ L，以每孔1 mL接种于6孔板中培养.第2日更换含不同浓度罗格列酮（1×10—6，1×10—5，1×10—4 mol/L）的新鲜培养基，继续培养24 h后消化收集细胞，PBS洗涤一次，750 mL/L乙醇固定，4 ℃冰箱保存.检测前用PBS洗2次，PI 染色，流式细胞仪（FCM）检测群体细胞中G0/G1, S, G2/ M各期细胞百分比.每个药物浓度做3个复孔，同时设不加药物的对照组.

毕业论文。

1.2.5Annexin V/PI法流式细胞仪检测细胞凋亡细胞接种密度及用药同细胞周期检测.罗格列酮作用24 h后消化收集细胞，PBS 洗2遍，用100 μL结合缓冲液重悬细胞，加5 μL Annexin VFITC和2.5 μL PI，混均，避光于冰上孵育10 min，PBS 洗1次，400 μL结合缓冲液重悬细胞，细胞样品逐一上机检测，同一浓度设3个复孔，试验同时设置不加药物的空白对照组. 论文网。

1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡将预铺多聚赖氨酸的盖玻片放入6孔培养板中，每孔接种3×105个细胞，第2日更换为含1×10—6，1×10—5，1×10—4 mol/L 3种不同浓度罗格列酮的新鲜培养基.药物作用36 h后弃培养液，PBS洗1次，40 g/L多聚甲醛室温固定25 min，按照原位检测试剂盒说明操作，最后以DAB显色、甲基绿衬染，每个浓度作2个复孔.在高倍镜（×200）视野下，随机选取10个视野，以凋亡细胞在全部细胞中所占的比例计算凋亡率.

统计学处理： 实验数据以x±s表示，用SPSS 13.0软件包对实验数据进行单因素方差分析(oneway ANOVA)，并用LSDt检验进行均数间的多重比较. 代写论文。

2结果 代写论文。

2.1对MDAMB231细胞体外增殖的影响对细胞生长的抑制作用随药物浓度增加而加剧，呈明显的量效关系, 除1×10—8和1×10—7 mol/L 2个浓度间的抑制率比较无统计学差异外［(11.2±2.0)%, (15.5±2.5)%, P0.05］，其余各组之间均存在统计学差异［(32.1±3.2)%, (62.0±5.1)%, (74.9±6.4)%, P均0.01）. IC50为5.2 μmol/L. 代写论文。

2.2对MDAMB231细胞周期的影响随着罗格列酮浓度的增高，G0/G1期细胞在细胞周期中所占的比例逐步上升，而S期细胞比例逐渐降低（表1）. 代写论文。

2.3罗格列酮抑制MDAMB231细胞增殖与PPARγ受体的关系给药后第2, 4, 6日，罗格列酮（1 μmol/L）组细胞计数（起始接种细胞数为5×104个/孔）分别为(1.06±0.14)×105 ，(3.85±0.69)×105和(7.45±1.30)×105个/孔，与1 mL/L DMSO对照组(2.46±0.44)×105，(17.10±1.69)×105和(28.82±2.79)×105个/孔比较，两组差异具有统计学意义(P均0.01)；而PPARγ受体拮抗剂GW9662（5 μmol/L）与罗格列酮（1 μmol/L）联用组的细胞计数分别为(1.72±0.20)×105，(6.63±0.58)×105和(11.90±1.21)×105个/孔，高于罗格列酮组（P均0.05）. GW9662（5 μmol/L）组的细胞计数结果与1 mL/L DMSO对照组比较，差异无统计学意义（P均0.05）.