VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、 纯化及鉴定

作者：魏玉英, 宋朝君, 孙元杰, 龚玖瑜, 金伯泉, 杨安钢, 杨 琨。

【摘要】 目的: 构建人血管内皮细胞生长因子II型受体（VEGFR2）胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法: 由公司合成VEGFR2胞膜外区第三、 第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列, 克隆入原核表达载体pGEX4T1中GST标签的下游, 构建重组表达载体pGEX4TVEGFR2D3.4, 将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS, IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白, 经不同浓度尿素洗脱纯化后, 表达产物用SDSPAGE和Western blot进行鉴定。结果: SDSPAGE分析表明, 表达产物的相对分子质量（Mr）为46 000, 与理论值相符, 主要以包含体形式存在; 灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6％, 纯化产物纯度最高为87.1％, Western blot 证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。结论: 利用大肠杆菌表达系统, 获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。

【关键词】 VEGFR2; GST; 融合蛋白; 原核表达; 纯化。

血管生成是一个严密调控的过程, 其在胚胎发育、 滤泡生长、 伤口愈合及肿瘤的生长转移等病理条件下都起着重要的作用。在几个可能调节血管生成的因子中, 血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体起着关键的作用。VEGF是一个同源二聚体蛋白, 具有促进血管内皮细胞生成、 有丝分裂及促进血管浸润活性的功能。在胚胎发育过程中, VEGF调节血管的发生及重塑, 而在成人体内, VEGF促进血管的生成［1］。

已经确认VEGF（如VEGFA）主要通过两个高亲和力的受体发挥作用: VEGFR1（Flt1) 及VEGFR2 （KDR/Flk1）。VEGFR2是I型跨膜糖蛋白, 胞膜外区有7个免疫球蛋白样结构域, 胞质区有一个激酶结构域, 被一个较大的激酶插入序列分割。 VEGFR2与配体结合后胞质区的激酶结构活化, 可以催化胞质中特定底物酪氨酸残基的磷酸化。VEGF及其受体的生理作用已在基因敲除的实验模型中得到了证实。将编码小鼠VEGF、 Flt1或 Flk1的基因靶向性敲除使得小鼠胚胎内血岛形成减少, 血管发生受损, 内皮细胞发育缺陷, 以致于不能形成正常的血管, 最终导致胚胎死亡。

Shinkai等［2］的实验证明, 在VEGFR2的7个胞膜外免疫球蛋白样结构域中, 第三个结构域在最小的配受体结合单位中最重要, 因为只含有前3个结构域或第三、 第四结构域的缺失突变体与VEGF的亲和力较含有7个完整的胞膜外结构域的突变体降为千分之一, 而第三个结构域缺失后将导致配受体结合功能的完全丧失。只含有第二及第三个结构域的突变体亲和力也只有原来的千分之一。通过对配受体结合的动力学分析发现, 第二及第四结构域在维持配受体的高结合力上起主要作用。两个结构域都决定了配体的特异性。此外, 第四个免疫球蛋白样结构域也涉及到受体的二聚体化。缺失该结构域的突变体不能形成紧密联系的二聚体, 因此, 结合到受体上的VEGF很容易脱落下来。

鉴于VEGFR2第三及第四免疫球蛋白样结构域的重要作用, 我们在本实验中构建了这部分的原核表达载体, 表达并纯化了目的蛋白, 为制备其单克隆抗体（mAb）、 进一步深入研究其功能奠定了基础。

1 材料和方法。

1.1 材料 大肠杆菌BL21(DE3) pLysS、 表达载体pGEX4T1为本室保存, 各种限制性内切酶、 T4 DNA 连接酶、 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）均为TaKaRa公司产品, 质粒提取盒、 胶回收试剂盒均为上海华舜生物工程有限公司产品。小鼠抗GST mAb为本室自行研制。碱基合成由上海海毅生物技术有限公司完成。

1.2 方法。

1.2.1 目的基因的获得及重组表达载体的构建 根据GenBank中人VEGFR2的cDNA基因序列, 委托公司合成第226至403位氨基酸（胞膜外区第三及第四免疫球蛋白样结构域）的编码碱基序列, 并在上下游分别引入EcoR I及Xho I的酶切位点。用这两种限制性内切酶酶切合成的基因片段及pGEX4T1表达载体, 胶回收纯化后, 将目的片段克隆入pGEX4T1中, 转化感受态DH5α细菌, 摇菌培养提取质粒, , 酶切鉴定并测序正确的重组质粒命名为pGEX4TVEGFR2D3.4。将质粒pGEX4TVEGFR2D3.4转化感受态菌株BL21(DE3) pLysS, 获得pGEX4TVEGFR2D3.4/BL21(DE3) pLysS表达菌种。

1.2.2 细菌培养及目的蛋白的诱导表达 将表达菌pGEX4TVEGFR2D3.4/BL21(DE3) pLysS划板培养并挑取单克隆接种于LB培养液中（含100 mg/L氨苄青霉素）, 37℃摇菌过夜, 次日以1∶1 000转接, 振荡培养至A600值达0.6时加入IPTG至终浓度1 mmol/L, 37℃诱导表达过夜, 4℃离心收集细菌备用。

1.2.3 包涵体的纯化 (1)超声破碎获得包涵体: 用裂解缓冲液（50 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl）重悬收集的细菌沉淀, 溶菌酶冰上作用2 h, 冰浴超声裂菌15 min。将超声破碎后的菌体悬液以5 000 r/min离心5 min。重复上述步骤3、 4次, 至离心后的上清液清亮不黏稠为止。收集上清液, 同时准备不同浓度的尿素洗涤沉淀。(2)洗涤包涵体: 将破碎后离心所得的沉淀依次用不同浓度的尿素洗涤, 2 mol/L、 4 mol/L各洗2遍, 6 mol/L、 8 mol/L各洗1遍, 12 000 r/min离心5 min。取超声裂解上清及不同浓度尿素洗涤、 纯化的上清行SDSPAGE电泳, 分析目的蛋白的表达形式以及融合蛋白纯化的最佳方案。

1.2.4 Western blot检测 蛋白纯化产物经SDSPAGE电泳分离后, 将融合蛋白转移至NC膜上, 5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入抗GST mAb, 4℃孵育过夜。PBST洗膜4次, 每次10 min, 再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG, 37℃温育1 h, PBST和PBS先后洗膜4次后, ECL化学发光显色。

2 结果。

2.1 重组质粒的构建和鉴定 将公司合成的VEGFR2 226403位氨基酸相应编码基因片段送测序, 确认与GenBank中相应区段的碱基无差别后, EcoR I及Xho I双酶切VEGFR2D3.4和pGEX4T1载体, 将目的片段亚克隆入pGEX4T1载体的GST标签下游, 获得重组融合蛋白表达载体pGEX4TVEGFR2D3.4, 以该连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌, 挑取单克隆摇菌后提取质粒, 用EcoR I及Xho I双酶切鉴定, 琼脂糖电泳后在相应约540 bp处得到1条DNA片段, 符合预期结果（图1）。

图1 重组表达质粒pGEX4TVEGFR2D3.4的酶切鉴定。

Fig 1 Identification of recombinant plasmids by restrictive enzymes digestion。

M: DNA marker; 1, 2: The plasmids digested by EcoR I and Xho I.