肾上腺髓质素缺失对单侧输尿管结扎小鼠MMP1/TIMP1表达的影响

作者：王香婷 许庆友 丁英钧　王月华 王筝 谷艳丽 张磊磊。

【摘要】 目的 探讨肾上腺髓质素在肾间质纤维化实验动物肾脏基质金属蛋白酶1/基质金属蛋白酶抑制剂1(MMP1/TIMP1)表达中的作用。方法 结扎肾上腺髓质素基因敲除小鼠及野生小鼠单侧输尿管，制备肾间质纤维化实验动物模型并给予缬沙坦灌胃治疗，采用免疫组化、原位杂交、RTPCR方法检测MMP1及TIMP1的表达。结果 单侧输尿管结扎 (UUO) 小鼠肾脏MMP1的表达减弱，而TIMP1的表达显著上调，基因敲除小鼠较野生小鼠更为明显，采用缬沙坦治疗可部分抑制TIMP1的表达。结论 肾上腺髓质素可以通过纠正MMP1/TIMP1的失衡，对UUO介导的肾间质纤维化起到保护作用。

【关键词】 肾上腺髓质素；单侧输尿管结扎；基质金属蛋白酶1；基质金属蛋白酶抑制剂1。

肾上腺髓质素是新发现的一种内源性血管活性肽，广泛存在于机体的各个重要脏器和多种组织，在心肾功能调节中发挥重要作用〔1〕。本文采用肾上腺髓质素基因敲除小鼠结扎单侧输尿管(UUO)制备肾间质纤维化实验动物模型，观察与细胞外基质沉积有密切关系的基质金属蛋白酶1(MMP1)及其基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)在基因敲除小鼠及野生小鼠的表达，并观察血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦对UUO小鼠的保护作用，从而探讨肾上腺髓质素对肾间质纤维化实验动物的保护作用及其与血管紧张素受体拮抗剂的相关性。

1 材料与方法。

1.1 实验动物。

肾上腺髓质素基因敲除小鼠(AMKO)和野生小鼠(WT)，雌性，体重16～22 g，8周龄，由东京大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂。

缬沙坦由北京诺华公司提供，MMP1、TIMP1抗体及原位杂交、SABC试剂盒均由武汉博士德生物有限公司提供。RTPCR试剂盒为Invitrogen Life Technogies产品。

1.3 肾间质纤维化模型建立。

小鼠于实验前分别置于代谢笼里取尿，检测尿蛋白和尿红细胞，结果均为阴性者用于实验。可自由进食和饮水，温度条件控制在(22±1)℃，12 h光/暗循环，两种小鼠随机各分为假手术组、模型组和缬沙坦组，每组5只。小鼠以10%水合氯醛以30 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉，腹部切开，暴露左侧肾脏，分离输尿管，于中上1/3处结扎并剪断。假手术组分离输尿管后缝合腹部。治疗组于术前1 d开始给予缬沙坦10 mg·kg—1·d—1灌胃，模型组和假手术组每日给予等容积的生理盐水。所有动物于术后第6天断头处死，切取左肾，留取肾组织标本。按冠状位纵形剖开，置于4%多聚甲醛 (含0.1% DEPC) 溶液中固定，石蜡包埋。同时留取部分新鲜肾组织保留于—70℃冰箱中以备提取总RNA用于RTPCR。

1.4 观察指标及方法。

1.4.1 组织学检查。

取左侧肾组织，用4%的多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，以3 μm的石蜡切片，行HE、Masson染色，光学显微镜下观察病理改变。

1.4.2 MMP1、TIMP1免疫组化表达。

采用免疫组织化学SABC法检测 (工作液浓度均为1∶70)。MMP1、TIMP1在组织中的表达半定量分析：任意选取40个高倍视野，将阳性信号分为0～4级，0级：无表达；1级：局部弱阳性表达；2级：局部中度表达或广泛弱阳性表达；3级：局部强阳性表达或广泛弱阳性表达；4级：广泛强阳性表达。以每个高倍视野平均得分标准作为比较。

1.4.3 MMP1、TIMP1原位杂交表达。

切片厚度为6 μm，常规脱蜡至水。3% H2O2室温处理10 min，蒸馏水洗涤2次。切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化40 min (暴露mRNA核酸片段)；PBS洗3次，蒸馏水洗1次。滴加预杂交液，恒温箱40℃ 4 h，吸取多余液体，不洗。按每张切片20 μl杂交液加在切片上，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱42℃杂交过夜。揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5 min×2次，0.5×SSC洗涤15 min×1次，0.2×SSC洗涤15 min×1次。滴加封闭液，37℃封闭30 min，甩去多余液体，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min；0.5 mol/L PBS洗5 min×4次。滴加生物素化过氧化物酶，37℃ 20 min；0.5 mol/L PBS洗5 min×4次。AEC显色，水溶性封片剂封片。评分方法同前。

1.5 MMP1、TIMP1 mRNA检测。

采用RTPCR检测。应用Trizol试剂提取肾组织总RNA，并按照逆转录试剂盒要求制备cDNA，随后进行PCR以扩增目的片段，βactin作为内参照，扩增引物序列如下：MMP1正义链：5′TGG ACC TGG AGG AAA TCT TGC3′，反义链：5′AGA GTC CAA GAG AAT GGC CGA3′；TIMP1正义链：5′ACT GCA GGA TGG ACT CTT GCA3′，反义链：5′TTT CAG AGC CTT GGA GGA GCT3′；βactin正义链：5′ TAC CGC TTC ACC ACC ACA GC3′，反义链：5′ AGG GAA GGC TGG AAA AGA GC3′。取cDNA 2 μl，加入引物2 μl、缓冲液5 μl、dNTP 5 μl、Taq酶1/8 μl，加双蒸水至50 μl。扩增条件为：变性：94℃，30秒；退火：55℃～59℃ 30 s；延伸：72℃ 30 s；30个循环。使用Gene Amp PCR系统9700(USA)。最后取20 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，于紫外灯下拍照，将胶片上的反应条带在IBAS2000图像分析仪中扫描。MMP1、TIMP1、βactin相对含量用相同PCR反应中光带的强度表示。

1.6 统计学处理。

数据以x±s表示，使用SPSS10.0统计软件，计数资料比较用秩和检验，两组均数比较用t检验。

2 结果。

2.1 肾脏组织学改变。

肾组织HE染色肾上腺髓质素基因敲除及野生小鼠假手术组均未见异常，模型组表现为近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张，上皮细胞坏死、脱落及细胞管型形成，大量炎性细胞浸润。缬沙坦治疗组略轻于模型组，但无明显差别。Masson染色显示：假手术组小鼠肾脏无异常；模型组肾组织切片表现为小管扩张，小管基底膜变薄，并出现了小管萎缩，间质胶原成分明显增多；缬沙坦治疗组胶原成分增多但较模型组为轻。与野生小鼠相比，基因敲除小鼠模型组胶原成分明显增多，经缬沙坦治疗有所改善。