大鼠STAT3信号分子对苦参碱对阿霉素诱导的肾小球硬化

【关键字】肾小球。

【摘要】 目的： 动态观察苦参碱对阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠STAT3分子及其抑制分子PIAS3变化的影响，探讨苦参碱在肾脏纤维化发病进程中的作用及其机制. 方法： 45只健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组及试验组各15只，用单侧肾切除加1 wk后尾静脉注射阿霉素(5 mg/kg)的方法建立肾小球硬化大鼠模型，为模型组；只行手术不注射阿霉素为对照组；造模后即予苦参碱100 mg/(kg·d)灌胃干预治疗为试验组. 于2,4,6 wk分批处死每组各5只大鼠，采用免疫组化检测肾脏STAT3、转化生长因子β1(TGFβ1)表达，实时荧光定量PCR技术观察STAT3，PIAS3 mRNA表达. 结果： 第6 wk时，模型组肾小球硬化指数（71.7±11.2）%高于对照组（17.6±2.5）%及试验组（44.9±8.9）% (P0.01)；模型组TGFβ1在肾皮质表达（2.196±0.394）%多于对照组（0.017±0.005）%及试验组（0.750±0.089）% (P0.01)，并呈逐渐升高趋势；模型组STAT3蛋白（19.58±2.66）%表达较对照组（7.64±1.25）%增高(P0.01),试验组（14.90±1.66）%较模型组（19.58±2.66）%降低(P0.01)；模型组STAT3 mRNA表达为5.06±0.26倍于对照组，高于试验组的3.49±0.39倍(P0.01)，而PIAS3 mRNA呈相反趋势. 结论： 苦参碱有抑制肾小球硬化进展的作用，其作用机制可能为下调JAK/STAT通路信号分子STAT3及上调其抑制分子PIAS3的表达，降低TGFβ1的蛋白水平，从而延缓肾小球硬化进程.

【关键词】 苦参碱;肾小球硬化症，病灶性;JAK/STAT信号转导通路;STAT3信号分子;大鼠;多柔比星。

【Abstract】 AIM: To dynamically observe the effect of matrine on STAT3 and PIAS3 in adriamycininduced glomerulosclerosis in rats and explore its protective mechanisms. METHODS: Fourtyfive male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: model group, control group and experimental group(n=15 in each group). Adriamycin nephropathy was induced by complete excision of left kidney and a single tail intravenous injection of adriamycin（5 mg/kg）; control group received only the operation but without intravenous injection of adriamycin; experimental group were treated with matrine 100 mg/kg·d after accomplishment of adriamycin nephropathy. Five rats in each group were sacrificed every 2 weeks. A semiquantitative score was used to evaluate the degree of glomerular lesions. Immunohistochemistry was employed to examine the expression of STAT3 and transforming growth factorβ1 (TGFβ1). Finally,the expressions of STAT3 and PIAS3 mRNA were measured by realtime quantitative RTPCR. RESULTS： Glomerulosclerosis index (GSI) in model group increased progressively（71.7±11.2）%, and was higher than that of control group（17.6±2.5）% and experimental group（44.9±8.9）% at week 6; Immunohistochemical staining indicated that STAT3 and TGFβ1 expressions gradually increased in model group［TGFβ1（2.196±0.394）%; STAT3(19.58±2.66)］ and were higher than those in control group［TGFβ1 （0.017±0.005）%; STAT3(7.64±1.25)%］ and experimental group ［TGFβ1(10.750±0.089)%; STAT3(14.90±1.66)%］at week 6. The expression of STAT3 gene in model group was increased compared with the control group (5.06±0.26 times higher than that of control group) and experimental group (3.49±0.39 times higher than that of experimental group), and PIAS3 mRNA expression change displayed an opposite tendency. CONCLUSION: Matrine has a depressive role in the development of glomerular sclerosis in adriamycininduced nephropathy rats. Its mechanism is considered to be related to intervention of the pathway of signal conduction of JAK/STAT: Upregulation of PIAS3, downregulation of STAT3, and decrease of TGFβ1 protein.

【Keywords】 matrine； glomerulosclerosis, focal； pathway of signal transduction of JAK/STAT； STAT3 signaling molecule；rats， doxorubicin。

0 引言 　　近年来研究发现，苦参碱（matrine）具有抑制成纤维细胞及胶原合成，防治实验性大鼠肝纤维化的作用. 但其对肾小球硬化作用及机制目前尚未完全明晰；信号转导子与转录激活因子(STAT)作为JAK的靶蛋白，是存在于细胞胞质中的一个转录因子家族，STAT3是该家族的重要成员. 研究表明STAT3途径不仅是参与肾脏疾病发病过程中一个很重要的信号转导途径，而且与多种增生性肾小球疾病的发生有关［1—2］. 本研究通过免疫组化及实时荧光定量PCR等方法，观察阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠模型及苦参碱干预治疗后肾组织STAT3、转化生长因子β1(TGFβ1)蛋白表达和STAT3，PAS3 mRNA表达，探讨苦参碱在肾小球硬化治疗作用及机制，为临床防治肾小球硬化寻找新的途径.

1 材料和方法。

1.1 材料 纯系健康Wistar大鼠45只，雄性，体质量(200±20) g，8～9周龄，普通级，兰州大学中心实验室动物中心提供（医动字第07371号）. 苦参碱(宁夏紫荆花药业股份有限公司，批号20070329)；阿霉素（深圳万乐药业有限公司产品, 批号:0703E2）；Trizol（上海生工生物工程技术服务有限公司）；Taq DNA聚合酶、MMLV逆转录酶、Oligo d(T)18,dNTP，DNA Marker,SYBR Premix Ex TaqTM（大连TaKaRa生物工程公司）；DEPC(上海实生细胞生物技术有限公司,为进口分装分析纯)；STAT3,PIAS3,内参照GAPDH的引物由大连TaKaRa生物工程公司合成；STAT3,TGFβ1兔抗大鼠mAb(武汉博士德生物工程公司)；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、羊抗鼠FITCIgG二抗作液（北京中杉金桥生物工程公司）.

1.2 方法。

1.2.1 模型制备及分组 大鼠给予普通饲料、自由饮水适应性饲养1 wk，随机分为3组： 对照组、模型组及试验组，每组各15只. 造模方法参照文献［3］采用单侧肾切除加单次阿霉素（5 mg/kg）尾静脉注射制作大鼠肾小球硬化模型；对照组行假手术,尾静脉注射等量蒸馏水. 从第1次注射阿霉素后开始干预治疗, 试验组给予苦参碱100 mg/(kg·d)灌胃，模型组和对照组每日给予等容积蒸馏水灌胃. 实验周期共6 wk.

1.2.2 标本制备 于实验第2,4,6 wk分批处死大鼠每组5只，迅速摘除左肾，将1/2肾组织置40 g/L多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋，制备肾组织HE，Masson染色和免疫组化标本，另1/2肾组织放入DEPC处理的冻存管，液氮保存，留待荧光定量PCR检测.

1.2.3 指标检测 （1）肾组织病理检查： 肾组织病变程度采用Raij［4］半定量积分法评估肾小球硬化程度，每张切片观察40个肾小球，然后计算肾小球硬化指数(glomerulosclerosis index,GSI). 每张切片肾小球平均硬化指数计算公式为：［(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/40］×100%，式中N1代表1级损害肾小球个数，N4为4级损害肾小球个数. （2）肾组织STAT3，TGFβ1蛋白表达的检测： 采用免疫组化SP法检测,将石蜡包埋的肾组织标本,4 μm厚切片，方法与步骤严格按说明书操作，一抗STAT3，TGFβ1，稀释倍数1∶100，并设阴性对照，以PBS代替一抗,DAB显色，苏木素复染，以光镜下细胞质出现棕黄色颗粒为阳性信号. 结果采用计算机图像分析系统进行半定量分析，每张切片按顺序选10个视野，按阳性染色面积所占视野百分比进行半定量评分后取均值. （3）STAT3，PIAS3 mRNA表达的检测：引物序列设计：内参照GAPDH正义引物、反义引物序列分别为5′GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3′，5′ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA3′,产物为143 bp；STAT3 正义引物、反义引物序列分别为5′CACAACCTGCGAAGAATCAAG3′，5′GCTGCTTCTCCGTCACTAC3′,产物为139 bp；PIAS3正义引物、反义引物序列分别为5′GTCGTCCAATCAACATCACAC3′，5′CTCACCAGGTACACAGACAAG3′,产物为118 bp. 经Blast分析引物与大鼠其他基因无同源序列. Trizol法提取细胞总RNA,取2 μg总RNA标本,采用两步法进行PCR： 第一步,利用反转录酶PrimeScriptTM RTase将RNA反转录成cDNA，反应体积为20 μL，反应体系如下: PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I，Oligo dT Primer，Random Primers各1 μL，5×PrimeScriptTM Buffer 4 μL, RNase Free dH2O 11 μL，反应条件: 42℃ 15 min, 85℃ 5 s；第二步，Real Time PCR反应：在RotorGene 3000 荧光实时定量PCR仪(Corbett Research公司)上进行反应，反应体积为25 μL，反应体系如下: SYBRPremix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer，PCR Reverse Primer各0.5 μL，RT反应液2 μL，dH2O 9.5 μL. 反应条件：预变性：95℃ 10 s，1个循环；PCR反应：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环. 通过荧光融解曲线检测各扩增产物的特异性，证明各扩增产物为特异性目的基因(图1 融解曲线峰值分别重合于84℃和85℃，无引物二聚体峰及非特异性峰产生). 由荧光曲线上读出CT值，以GAPDH为内参照,用2 ΔΔCT法［5,6］计算STAT3，PIAS3 mRNA的相对表达量. 用公式表达如下:ΔΔCT =各组(CT检测指标 CTGAPDH) 对照组(CT检测指标 CTGAPDH),各组基因表达量/对照组基因表达量= 2ΔΔCT.

统计学处理： 计量资料采用x±s表示,用SPSS11.5统计软件分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用取LSDt检验,P0.05为差异有统计学意义.

A: STAT3; B: PIAS3.

图1 STAT3，PIAS3 mRNA实时荧光定量PCR融解曲线（略）。

2 结果。

2.1 肾组织病理形态学光镜观察及肾小球硬化指数 光镜下对照组HE和Masson染色肾小球和肾小管及间质结构正常；模型组见肾小球局灶节段性肾小球硬化、囊腔增大、系膜增殖、细胞外基质明显增多，伴有肾间质淋巴细胞浸润，增宽的间质区有胶原纤维增生（图2）. 试验组病理改变较模型组改善. 模型组的肾小球系硬化指数第6 wk高于对照组和。

试验组，差异均有统计学意义(表1）.