人工血管表现内皮细胞种植研究的进展
关键词：人工血管内皮细胞血液相溶性 摘要材料植入机体诱导的血栓形成是人工血管临床应用最为主要的限制因素之一，在材料表现种植内皮细胞可能是目前解决这一问题最有效的方法，本文试就血管内皮细胞的促凝及抗凝功能、内皮细胞在材料表现生长分化的影响因素和人工血管内皮细胞种植的实验室研究与临床等方面的最新进展及其应用前景作为简要介绍。
1引言 血栓形成是人工血管尤其是微小血管临床应用的最为主要的限制因素之一，为了改善血管材料的血液相容性，人们曾先后进行了多方面的尝试，如新材料的合成、材料表现的生物改性等，遗憾的是目前的结果仍不能令人十分满意。血管内皮细胞不仅仅是在血管表现的一层物理屏障，更为重要的是其在血管伸缩的调节，凝血一纤溶系统平衡的维系以及免疫系统的调控等方面起着不可缺少的功能和作用，同时它还参与机体的生物代谢、能量运输和内分泌系统的调节。现在人们已起来越明确地认识到内皮细胞衬层在改善血管材料血液相容性中的重要性[1]，在这方面的研究也日益引起人们的广泛关注并已取得了可喜的进展，本文试就近几年的有关进展加以综述。 2血管内细胞在凝血一纤溶系统中的功能和作用 血管内皮细胞直接与血液接触，既有促凝血功能，又有抗凝血功能，对调节凝血因子和抗凝血因子之间的动态平衡和维持血液的正常流动起着十分重要的作用，各种原因引起的这种平衡的失调，都将导致血栓形成（凝血因子活性增强）或出血（抗凝血因子活性增强）。 2.1血管内皮细胞的促凝血功能 血管内皮细胞能合成和释放多种促进血小板聚集和血栓形成的因子以及部分凝血因子，主要有胶原蛋白、纤粘蛋白、组织因子、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅷ、vWF因子及高分子量激肽原（highmolecularweightkininogen,HMWK）、纤溶酶原激活物抑制物（plasminogenactivatorinhibitor,PAI）、血小板激活因子（plateletactivitingfactor,PAF）和血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）等。这些因子协同其他凝血因子参与凝血过程的起始（如TF和HMWK）、凝血酶原激活物的形成（如Ⅴ因子和Ⅷ因子）、血小板的粘附、聚集和血栓形成（如胶原蛋白、纤粘蛋白和PAI等）等过程。 2.2血管内皮细胞的抗凝血功能 血管内皮细胞除了合成、分泌上述各种促凝血因子以外，还具有抗凝血的功能。血管内皮细胞的抗凝血功能主要通过合成下列三类主要的抗凝血因子得以实现。第一类物质主要是包被在内皮细胞表面，这里面主要有蛋白聚糖（proteoglycan）和血栓调节蛋白（thrombomodulin），内皮细胞表现的蛋白聚糖能通过与抗凝血酶Ⅲ结合从而促进其灭活凝血酶及其他凝血因子的活性；而血栓调节蛋白与内皮细胞表面的凝血酶结合后，可以激活蛋白C，活化的蛋白C可灭活Ⅴa因子和Ⅷa因子，并可抑制血小板受体进而抑制血小板聚集和纤维蛋白凝结。第二类物质是由内皮细胞合成并释放到血液中去的因子，这些因子可以影响凝血因子、血小板和血管平滑肌细胞，进而促进凝血过程，在这一类因子中有前列环素（prostacyclin）、纤溶酶原激活物（plasminogenactivator,PA）、内皮依赖性舒张因子（endothelium—dervedrelaxingfactor,EDRF）和组织因子途径抑制因子（tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI）等，当纤维蛋白形成并沉积于内皮细胞表面时可诱发PA的释放，PA的功能是活化纤溶酶原使其转化为纤溶酶，清除纤维蛋白；前列环素和EDRF协同作用除可张血管外，还可以抑制血管内皮细胞合成血小板粘附蛋白进而抑制血小板的粘附与聚集；TFPE分子含有三个Kunitz功能区，分别可以和组织因子—Ⅶ因子复合物、Xa因子及肝素结合，从而抑制外源性凝血途径的初始过程[2]。第三类物质是一些在内皮细胞内起作用的因子如13—羟基—9，11—十二烷基二烯酸（13—hydroxy—9,11—octadecodienoicacid）[3]。除了上述三类因子以外，其它一些非内皮细胞来源的抗凝血因子（如抗凝血酶Ⅲ等）也可特异地吸附在内皮细胞表面并连同一些内皮细胞来源的其他物质组成一些抗凝表面。同时内皮细胞还可摄取和灭活一些对小板聚集有促进作用的活性物质如5—羟色胺、组织胺、儿茶酚胺、缓激肽、血管紧张素和血小板激活因子等，间接起到了抗凝血的作用。 3血管内皮细胞种植的研究 现在我们已经知道内皮细胞在凝血及纤维系统中起着举足轻重的作用和功能，因此从理论上讲，在人工合成血管材料表现铺被一层内皮细胞将会明显改善其血液相容性。最早在这方面开展研究的Herring，在1978年首先报导了内皮细胞种植于Dacron人工血管后植入狗的动脉系统的实验，结果发现，术后四周种植内皮细胞的人工血管表现无血栓面积大约为70%，而单纯的人工血管表面无血栓面积则仅为22%[4]。随后Stanley和Sharefkin等分别报导了各自研究的结果，证实内皮细胞种植能够明显改善Dacron人工血管植入动物内后的通畅率和减少血小板聚集[5，6]。Douville及Hirko各自的研究结果显示，内皮细胞种植对聚四氟乙烯（PTFE）人工血管植入动物体内后的通畅率也有明显的改善作用[7，8]。Meinhart等长达8年的临床研究中将病人分成两组，一组移植内皮细胞化的ePTFE血管（A组），而另一组则移植普通ePTFE血管（B组），结果显示手术3年、5年及7年后A组病人的血管畅通率分别为84.7%、73.8%和73.5%，而B组病人的血管畅通率则分别为55.4%、20.8%和0%。他们的研究提示，内皮细胞化的血管材料的移植效果与自体动脉移植的临床效果无明显区别[9]。相关的研究提示，传统的聚氨酯材料不太支持内皮细胞的粘附与生长，因此用其进行的内皮细胞种植实验效果不明显。 通常采用的将内皮细胞种植到人工血管表面的方法分为两种：第一种称为接种法（seeding），即将内皮细胞与全血管或血浆混合后注入人工血管腔，使内皮细胞沉积于人工血管内腔表面；另一种方法称为铺坪方法（sodding），即将自体内皮细胞经体外培养扩增后与人工血管培养，使内皮细胞直接铺展在人工血管内腔表面。前一种方法的优点在于所需时间短，缺点是内皮细胞与血管材料表面的结合不牢固，缺点是细胞体外培养时间过长，污染机会多。Williams等采用的加压铺坪法（pressuresodding）值得我们借鉴。他们的方法是将微孔状的聚四氟乙烯人工血管的一端堵住，另外一端通过T形管分别与压力计和注射器相连。在管腔压力维持在5psi的状况下将细胞悬浮液通过注射器注入人工血管内，并用注射器缓慢推进4倍于人工血管容积的铺坪液，以确保细胞能完全进入血管材料的网孔内。他们将通过这种方法处理的4mm内径的聚四氟乙烯血管植入狗的颈动脉并于术后12周检查血管通畅情况，结果显示，有86%的移植血管保持通畅，而未经细胞处理的移植血管则已全部闭塞[10]。 为了改善内皮细胞在人工血管表面的粘附和生长，人们先后尝试了在血管材料表面加附各种细胞粘附因子如胶原（collagen）、纤粘蛋白（fibronectin）、层粘联蛋白（laminin）、玻联蛋白（vironectin）及细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）等并取得比较满意的效果。后来，Pierschbacher和Rouslahti发现RGD（精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸）三肽是许多细胞膜和ECM中的粘附蛋白（如玻联蛋白、纤粘蛋白、vonwillebrand因子、纤维蛋白原及胶原等）所共有的细胞间识别的最小序列，而这一序列在介导细胞粘附和铺展方面起着非常重要的作用[11，12]。现已证明细胞表面的某些受体如整联蛋白（integrin）通过识别粘附因子的RGD序列介导细胞间的聚集及细胞在ECM上的粘附和铺展。随着对含RGD多肽与整联蛋白相互作用机制的深入了解，人们逐渐认识到，将含RGD三肽序列的合成多肽共价连接到合成材料表面应可促进细胞的粘附与生长。含RGD序列的合成多肽固定在生物材料表面能明显促进内皮细胞的粘附与铺展，这已在多种生物材料的有关研究中得到证实[13，14]。同时在材料表面交联某些生长因子如碱纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）及内皮细胞生长因子（endothelialcellgrowthfactor,ECGF），也能明显改善内皮细胞在材料表面的生长状况。在这方面工作中所面临的最主要的挑战是寻求一种有效的交联方法，即在最大限度地保持RGD多肽或各种细胞生长因子的细胞结合活性的前提下，交联尽可能多的分子到材料表面。 除了在材料表面加附各种有利于细胞粘附、铺展及生长的各种细胞活性因子外，人们还发现，赋予材料表面一种必要的三维结构也是促进细胞粘附及生长，尤其是保持细胞功能分化的不可缺的因素之一。人们早已发现内皮细胞在不同铺展形态时其功能分化程度是不同的。有的研究发现，细胞与细胞基质的相互作用所产生的基质机械力可以明显影响细胞的表型分化（phenotypicdifferentiation），如细胞的生长、细胞的形态、胞内的pH、及胶原与纤粘蛋白的合成等[15—17]。某些研究中发现，内皮细胞化材料表面仍经常有血栓形成，推测其原因可能与内皮细胞的抗凝血功能方面的分化缺陷有关。Goodman等通过两步法制备了一种模拟正常血管基底组织三维构象的聚氨酯人工血管材料，他们研究提示，血管内皮细胞在这种三维材料上的铺展及生长比平面形态表面明显得到改善，并且内皮细胞的形成更接近生理状态时的形成[18]。Tunstall等的研究比较了血管内皮细胞在具有不同表面结构的Dacron材料表面上生长时组织因子和前列环素的表达情况，他们的研究显示，内皮细胞在纺织人工血管表面生长时，其组织因子的表达水平明显低于生长于光滑表面Dacron膜的内皮细胞，而前列环素的表达水平在两组之间则无显著区别[19]。Genni等研究了内皮细胞在编织Dacron材料表面生长时各种粘附分子的表达情况，他们的结果显示，内皮细胞在接触材料24小时后，其表面表达血小板和内此细胞粘附分子（platelet/endotheliumcelladhesionmolecule,PECAM—1）的细胞数明显减少，而表达内皮细胞—白细胞粘附分子（endothelium—leukocyteadhesionmolecule,ELAM—1）的细胞数明显增多，材料对细胞表达血管细胞粘附分子（vascularcelladhesionmolecule,VCAM—S）和细胞间粘附分子（intercellularadhesionmolecule,ICAM—1）几乎不产生影响。他们认为这种情况的出现有利于白细胞与内皮细胞间的粘附，而不利于内皮细胞与材料间及内皮细胞之间的粘附，因而阻碍了材料表面的内皮细胞化[20]。Fields等制备了一种称为肽—双亲体（peptideamphile）的结构分子，其一端为亲脂性基团，可以和材料的疏水性表面结合，而另一端为亲水基团，可以和蛋白及多糖等亲水性分子结合，他们在其亲水端引入一个三螺旋结构（triplehelicalmotif），其在生理温度下相当稳定。用这种分子处理的材料可以明显促进内皮细胞的粘附、生长和细胞内信号的传递[21]。 4结束语 通过对上述研究工作的了解，可以看出，血管材料表面内皮细胞化能够明显改善移植后的血管通畅率，因而具有广阔的临床应用前景。但要使血管内皮细胞化人工血管真正进入临床广泛使用，还有几个问题迫切需要解决；一是如何缩短内皮细胞的种植时间从而减少污染的机会；二是要彻底了解影响内皮细胞在材料表面粘附、铺展、生长及功能分化等方面的各种因素，为日后材料的制备提供理论基础。更为理想的是研制这样一种血管材料，当其植入体内后能诱导邻近血管平滑肌细胞和内皮细胞向其表面迁移并进行铺展，从而形成一种完整的具有正常生理功能的内皮细胞层，这样将会使其临床应用更为简易。此外在体外培养条件下进行血管诱导再生的研究也应引起我们足够的重视。