冬凌草甲素通过激活caspase途径诱导人乳腺癌MDA—MB—231细胞凋亡
作者：江永青, 熊向阳,余乐涵。
【摘要】 目的研究冬凌草甲素诱导人乳腺癌MDA—MB—231细胞凋亡的作用原理及caspase途径在凋亡过程中的作用。方法噻唑蓝(MTT)法,形态学观察, RT—PCR及流式细胞法。结果冬凌草甲素对MDA—MB—231细胞生长抑制作用呈时间剂量依赖性。形态学观察可见MDA—MB—231的增殖受明显抑制。冬凌草甲素可诱导细胞内抑制凋亡基因Bc1—xl表达量时间依赖性减少，促凋亡基因Bid表达量增加，caspase—3 的表达增加。40 μmol/L药物处理48 h后，流式法检测细胞凋亡率为75%。结论冬凌草甲素诱导MDA—MB—231细胞凋亡,这种作用可能是通过改变Bc1—xl/Bid的表达比率、 激活caspase—3 而实现的。
【关键词】 冬凌草甲素 MDA—MB—231细胞 凋亡 Bc1—xl/Bid caspase—3。
Abstract：ObjectiveTo study the mechanisms of oridonin—induced human breast cancer MDA—MB—231 cell apoptosis，and to examine the role of caspase pathway in the apoptosis process.MethodsMTT，observation of morphology, RT—PCR and flow cytometry．ResultsOridonin inhibited MDA—MB—231 cell growth in time—and dose—dependent manners,decreased the expression of antiapoptotic mitochondrial gene bcl—xl time—dependently，and increased the expression of proapoptotic gene bid and caspase—3．The apoptosis rate was 75% by flow cytometry after treatment for 48 hours at the concentration of 40μmol/L. ConclusionOridonin maybe induce MDA—MB—231 cell apoptosis through alternation of the ratio of Bc1—xl/Bid and activation of caspase—3.
Key words：Oridonin； MDA—MB—231 cells； Apoptosis； Bc1—xl/Bid; Caspase—3。
冬凌草甲素(oridonin)是从唇形科(Labtea)香茶菜属(Rabdosia)植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类(ent—kaurene diterpenoid)天然有机化合物，为无色棱柱状结晶，味道极苦，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂。冬凌草甲素能够抑制多种肿瘤细胞系的增殖，目前已经发表的研究主要是针对肝癌、白血病、淋巴瘤细胞，如K562［1］、HL — 60［2］，但尚未见到关于该药作用于乳腺癌细胞MDA—MB—231的报道。本文以MDA—MB—231细胞为材料, 应用MTT、RT—PCR 、流式细胞仪研究了冬凌草甲素对MDA—MB—231细胞增殖的抑制作用及诱导MDA—MB—231细胞凋亡的机制。
1 材料与仪器。
人乳腺癌细胞MDA—MB—231（由南昌大学医学院生物化学实验室保存）；冬凌草甲素（中药固体试剂制造技术国家工程研究中心）；10%胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；HyQ改良型1640培养基（海克隆生物化学制品北京有限公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Inviyrogen公司）；四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Solarbio公司）；二甲基亚砜(DMSO)（美国Amresco公司）；RT试剂盒（美国Fermentas公司）。15AC 5% CO2的培养箱（美国SANYO公司）；Gene Genius 全自动凝胶成像分析系统(英国Syngene公司)；4314型倒置显微镜（美国Cioc）；Facscallbar流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司)。
2 方法。
2.1 细胞培养MDA—MB—231细胞，在含10%胎牛血清的HyQ改良型1640培养基，37℃、5% 的CO2饱和湿度培养箱中培养。
2.2 细胞毒实验（MTT法）取对数生长期的MDA—MB—231细胞200 μl接种于96孔板中（2×104个/ml），培养48 h后加入不同浓度的冬凌草甲素(用DMSO溶解, 其浓度 0.01 %)，每个药物浓度设5个平行复孔，另设DMSO对照组(DMSO浓度为 0.01 %)和正常对照组。分别培养24，48，72 h，到终止培养前4h，每孔加入MTT（5 μmol/L）20 μl，继续培养4h后终止培养，小心吸出孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震荡混合仪震荡10 min，使结晶充分溶解。选择490 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)。 按公式计算抑制率：抑制率(%)=(1—实验组OD值/对照组OD值)×100%。用IC50软件算出IC50值（细胞抑制率为50%时的药物浓度）。MTT实验证实OMSO＜0.01%，对细胞无抑制作用，以下各组实验均以DMSO组为对照组（OMSD＜0.01%）。
2.3 细胞形态学观察以每孔2×104个/ml细胞密度接种于6孔板中，培养24 h后，空白对照组和冬凌草甲素4个剂量组分别加入浓度为0，5，10，20，40 μmol/L冬凌草甲素。72 h后在倒置显微镜下观察细胞形态学变化。
2.4 半定量RT—PCR检测相关基因的表达变化取经药物作用48 h后各实验组的MDA—MB—231细胞，按Trizol Reagent试剂盒说明书提取MDA—MB—231细胞总RNA，按照RT试剂盒（美国Fermentas公司）的说明操作，进行RT—PCR。引物设计借助引物设计软件Primer Premier 5.0 设计正义和反义引物。见表1。表1 RT—PCR引物序列（略）。
反应条件：Bcl—xl: 94℃ 3 min; 94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 45 s，35个循环；结束前72℃延伸10 min。Bid: 94℃ 3 min; 94℃ 45 s, 56℃ 45 s, 72℃ 45 s，35个循环；结束前72℃延伸10 min。caspase—3: 94℃ 3 min; 94℃ 45 s, 50℃ 45 s, 72℃ 45 s , 35个循环；结束前72℃延伸10 min。
2.5 流式细胞仪测凋亡选取40 μmol/L冬凌草甲素作用细胞48h，处理完毕后，常规消化，制成单细胞悬液，将约1×106个细胞移入离心管中，1 000 r/min，离心10 min，弃上清后，用PBS溶液洗涤两遍，在离心管中留约0.5 ml的PBS溶液，用吸管吹打使细胞悬浮，快速加入70%冷乙醇固定，4℃固定12 h以上。检测时，离心弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶Inil(pH值1.5～2.0)消化10 min，PBS溶液冲洗1次，采用碘化丙啶(PI)一步插入性DNA定量荧光染色法，染液中含PI 50 mg/L，Triton X 100 1.0%。每份样品中加入DNA染液1.0 ml，4℃染色30 min，以500目筛网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，上机检测细胞凋亡率。
2.6 统计学处理所有实验结果数据均用±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行处理，分析方法采用方差分析,以P﹤0.05为显著性差异。