纳米羟基磷灰石—40%二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性评价
作者：李超 陶树清 周长林 逯代峰 荣杰生。
【摘要】 ［目的］评估纳米羟基磷灰石—二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性。［方法］根据ISO10993—1标准，采用细胞毒性试验、急性毒性试验、溶血试验和体内植入(90 d)试验对纳米羟基磷灰石—二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性进行评估。［结果］纳米羟基磷灰石—二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性的细胞毒性评分小于I级，细胞生长无明显抑制现象，无急性毒性反应，无溶血反应，体内植入符合植入材料生物学评价要求。［结论］纳米羟基磷灰石—二氧化锆生物陶瓷材料具有良好的组织相容性，作为骨组织工程中生物支架材料具有广阔临床应用前景。
【关键词】 羟基磷灰石 二氧化锆 组织相容性 Abstract: ［Objective］To evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite—zirconia composite bioceramic. ［Methods］According to the standard of ISO 10993—1,cytotoxicity experiment,acute toxicity test,hemolysis test and in vivo implantation(90 days) test were conducted to evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite—zirconia composite bioceramic.［Results］The score of cytotoxicity experiment was lower than grade I,and there was no significant inhibition of cell growth,no acute toxic reaction or hemolytic reaction.And the in vivo implantation met the requirements of the biological evaluation of implant materials.［Conclusion］Nano hydroxyzpatie—zirconia composite bioceramic showed a good histocompatibility.It has a broad prospect as a biomaterial scaffold in the bone tissue engineering.
Key words：hydroxyapatite; zirconia; histocompatibility 生物陶瓷是目前骨组织工程常用的支架材料，传统的生物陶瓷材料由于粒径较大，气孔大，其脆性及弹性模量较大，影响了在生物医学领域的应用［1］。由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备的纳米羟基磷灰石—40%二氧化锆(nano hydroxyapatite—40%zirconia，nano HA—40%ZrO2)陶瓷材料强度、硬度、韧性和超塑性上都得到提高，如在人工器官制造，临床应用等方面将比传统陶瓷有更广泛的应用并具有极大的发展前景。本研究选用细胞毒性试验、急性毒性试验、溶血试验，植入实验评价纳米HA—40%ZrO2组织相容性，初步评价该材料应用于临床医学的可行性。
1 材料和方法。
HA／40%ZrO2、HA由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备，用溶胶—凝胶(sol—gel)法制成纳米羟墓磷灰石粉粒(HA)［2］，然后将质量比按60%纳米HA+40%二氧化锆比例配制，纳米HA和二氧化锆粉体经充分研磨后得到纳米羟基磷灰石／二氧化锆复合粉体，采用热压低温烧结技术磨削制成3 mm×3 mm×5 mm长方体。将经过环氧乙烷灭菌的上述复合材料以1 g材料／5 ml介质的比例，放入生理盐水或小牛血中，37℃恒温箱中静置浸提72 h制备成HA／40%ZrO2浸提液，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。
1.2.1 实验方法。
采用L929细胞(哈尔滨医科大学遗传实验室馈赠)经复苏、传代后，将细胞培养基配制1×104个／ml细胞悬液分注于96孔塑料培养皿中，每孔100 μl，每组每观察期至少8孔，细胞培养箱内培养24 h。然后弃去原培养基，用PBS洗涤2次，试验组加入100 μl小牛血清浸提液，阴性对照组加入100 μl小牛血清，阳性对照组加入64 g/L苯酚溶液，继续培养1、2 d和3 d。弃去培养皿中的浸提液和培养基，加入20 μl/孔的MTT液，继续培养6 h，吸去原液，加入150 μl／孔二甲亚砜，振荡10 min，在BECKMAN DU640紫外分光光度计以500 nm波长测定吸光度OD值，并计算细胞的相对增殖度(RGR)。RGR=(试验组OD值—空白OD值)／(阴性对照组OD值—空白OD值)。
1.2.2 细胞毒性分级与判定。
RGR≥100%评为0级；RGR在75%～99%之间评为I级；RGR在50%～74%之间评为II级；RGR在25%～49%之间评为Ⅲ级；RGR在1%～24%之间评为Ⅳ级；RGR为0时评为V级)。实验结果为1或0级反应为合格，实验结果为Ⅱ级反应时需结合细胞形态综合评价，实验结果为Ⅲ～V级反应为不合格。
1.3 急性全身毒性试验。
1.3.1 动物分组及实验方法。
将20只昆明小鼠(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)，雌雄各半，体重（20±2.0） g，随机均分为实验组和对照组，实验组用生理盐水HA／40%ZrO2材料浸提液，对照组用生理盐水，均以50 ml／kg剂量通过小鼠腹腔注射，观察注射后24、48和72 h动物的一般状态、毒性表现。
1.3.2 结果评定。
72 h内实验组反应小于对照组为符合要求；实验组中40%死亡，或60%出现明显毒性反应，或动物普遍出现进行性体重下降为不符合要求。
1.4.1 制备新鲜稀释血。
经肘前静脉抽取健康人(8人，男性)静脉血4 ml，混入3.2%柠檬酸钠缓冲剂0.4 ml，加入生理盐水5 ml进行稀释即制备出新鲜稀释血。
1.4.2 实验分组及方法。
实验组取HA／40%ZrO2浸提液10 ml，阴性对照组取9 g/L生理盐水10 ml，阳性对照组取蒸馏水10 ml，每组各取8个试管，将所有试管放入37℃恒温箱中水浴30 min，各试管内分别加入新鲜稀释血0.2 ml轻摇，37℃恒温保留60 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液在紫外分光光度仪上测定545 nm处的光吸收度(A)。溶血率计算公式：溶血率=(实验组吸光度—阴性对照组吸光度)／(阳性对照组吸光度—阴性对照组吸光度)×100%。
1.4.3 结果评定。
1.5 肌肉内种植实验。
1.5.1 实验分组及方法。
选用Wister大鼠40只(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)，雌雄各半，体重（220±25） g，随机分为术后第7、15、30、90 d 4组，每组10只。将HA—40%ZrO2材料块环氧乙烷消毒后备用。常规麻醉消毒，在大鼠脊柱右侧1.0 cm处做切口，分离竖脊肌，于肌肉内植入HA／40%ZrO2材料块，缝合肌膜和皮肤。术后每日予以青霉素20万U肌注，连续3 d，于术后第7、15、30、90 d取材。