兔眼IPE与RPE细胞膜表面K—NPPase酶组织化学的电镜图像分析
【摘要】 为了探讨自体虹膜色素上皮细胞（IPE）能否代替视网膜色素上皮细胞（RPE）移植到视网膜下腔执行物质转运功能，对兔眼IPE与RPE细胞膜表面的Na+，K+—ATPase采用K—NPPase酶组织化学技术进行定位和分析比较。方法：家兔12只，取IPE和RPE组织固定，配制孵育液后进行K—NPPase酶组化孵育，制成电镜标本，采集图像，利用Metamorph/DP10/BX51系统进行分析。随机选取IPE细胞膜以及RPE细胞顶端相邻K—NPPase颗粒两点间的距离进行测量。计算每组样本的均值±标准差（x ±s ），进行成组设计材料的t检验。结果：有色素组与无色素组汇总后的IPE细胞膜上K—NPPase颗粒的距离平均值40.16±1.19nm，RPE顶端微绒毛细胞膜上K—NPPase颗粒的距离平均值为41.07±1.78nm，两者之间的差异无显著性意义（0.5＞P ＞0.2）。 结论：兔眼IPE细胞膜表面与RPE细胞顶端微绒毛膜表面均有Na+，K+—ATPase分布，采用K—NPPase酶组化电镜观察到的兔眼IPE细胞与RPE细胞可能具有相似的物质转运功能。
0引言。
近年来，随着视网膜玻璃体手术技术和细胞培养技术的成熟，通过自体色素上皮细胞移植治疗老年性黄斑变性（ARMD），提高和挽救ARMD患者的视力成为可能。由于虹膜色素上皮细胞（IPE）与视网膜色素上皮细胞（RPE）有相同的组织来源，且取材容易，人们寄希望于通过自体IPE细胞移植来重建视网膜光感受器复合体的结构与功能。大量报道也证明了IPE细胞与RPE细胞具有相似的吞噬功能[1—4]、摄取和贮存维生素A的功能[5]及产生细胞外间质的功能[6]，但是关于二者物质转运功能的量化比较研究甚少。我们通过钾依赖性对硝基苯磷酸酶（K—NPPase）组化方法[7]显示IPE与RPE细胞膜表面的钠钾ATP酶（Na+，K+—ATPase），对二者的物质转运功能进行量化分析比较，为进一步阐述IPE代替RPE自体移植的可行性提供理论依据。
1材料和方法。
1.1材料 健康有色素家兔与白色家兔各6只，由中国医科大学实验动物部提供，质量2.5～3.0kg，平均兔龄6mo，雌雄不限。成组设计为有色素组12眼和无色素组12眼；有色素组和无色素组又分别分为IPE组和RPE组各12例。耳缘静脉注射5.0mL空气处死后，无菌操作下摘取家兔双眼球。用40g/L多聚甲醛和5g/L戊二醛混合液（含60g/L蔗糖）球内灌注及浸泡固定，4℃，45min，将组织切成2mm×4mm的薄块。
1.2方法 K—NPPase酶组化孵育液配制[7]：于1mol/L甘氨酸—KOH缓冲液（pH＝9.0）中加入左旋咪唑6.02mg及对硝基苯磷酸（Mg盐）24mg,充分混匀溶解，慢慢滴入DMSO 2.5mL（a液）将枸橼酸铅溶于50mmol/L的KOH溶液中配成4.0mmol/L浓度的溶液，摇匀使之溶解（b液）。将所配制的枸橼酸铅—KOH溶液（b液）缓慢滴入a液中，最终孵育液呈半透明微绿色。K—NPPase酶组化孵育：将组织薄块浸入孵育液中，置于37℃温箱中，孵育40~50min。将孵育后的组织薄块用100mmol/L二甲砷酸缓冲液洗涤5min；置于10g/L锇酸—100mmol/L二甲砷酸缓冲液中固定30min；用100mmol/L二甲砷酸缓冲液冲洗2次，各5min；依次用梯度乙醇脱水，再用纯丙酮浸30min 2次；环氧树脂（Epon812）浸透、包埋、聚合；切半薄切片后在光镜下定位，修块；超薄切片70nm，醋酸双氧铀电子染色10min，烘干；电镜观察，拍照。采用Metamorph/DP10/BX51系统分析电镜照片。随机选取IPE细胞膜上K—NPPase的阳性颗粒以及RPE细胞顶端和ROS相接的微绒毛上的阳性颗粒相邻两点间的距离进行测量。
统计学处理：计算每组样本的均值±标准差（x±s，95%可信区间），分别对有色素组和无色素组的IPE组与RPE组数据进行统计学分析比较，最后再对总的IPE组和RPE组进行t检验。
2结果。
电镜下RPE细胞顶端伸出大量微绒毛包绕ROS，沿绒毛膜处可见K—NPPase颗粒沉积（图1）；IPE细胞之间有许多微绒毛互相交叉盘绕，在其表面可以见到大量K—NPPase颗粒沉积，沿细胞膜成行排列位于细胞质侧（图2）。这两种组织与其它未被K—NPPase着染的组织相比，定性观察结果呈明显阳性。有色素组与无色素组汇总后的IPE细胞膜上K—NPPase颗粒的距离平均值40.16±1.19nm，RPE顶端微绒毛细胞膜上K—NPPase颗粒的距离平均值为41.07±1.78nm，两者之间的差异无显著性意义（0.5＞P＞0.2，表1）。
图1 ①视杆细胞外节；②RPE细胞顶端；③微绒毛膜表面的K—NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×35 000。
图2 IPE细胞纵横交错的微绒毛边缘可见成排的K—NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×35 000。
3讨论。
Schraermeyer等[8]应用酶联免疫细胞组织化学观察体外培养的IPE细胞具有Na+，K+—ATPase活性，但这只是定性观察结果。众所周知在RPE细胞顶端微绒毛膜上也存在Na+，K+—ATPase[9]，我们希望通过一种量化的方法比较二者的差异。Mayahara等[7]开发的钾依赖性对硝基苯磷酸酶（K—NPPase）组织化学方法，K—NPPase在钾离子存在的情况下，能水解对硝基苯磷酸，这个反应可以被Na+，K+—ATPase的特异性抑制剂奎巴因所抑制，而且在高倍电镜下K—NPPase的反应产物位于细胞膜的细胞质侧，这与Na+，K+—ATPase脱磷酸反应过程中磷酸释放的方向一致，更进一步说明K—NPPase是Na+，K+—ATPase中钾离子依赖性脱磷酸反应部分。K—NPPase在视细胞内节盘膜表面呈清晰排列（图3）代表了Na+，K+—ATPase的分布，是光感受器进行正常光电化学反应的前提与基础[10]。我们通过K—NPPase组织化学方法来显示正常生理状态下IPE与RPE细胞膜表面的Na+,K+—ATPase的活性分布，并创造性的通过Metamorph系统测量电镜图像中K—NPPase沉积颗粒的距离，对其分布密度进行量化评价、分析比较。