中华补血草根提取物对DGalN/LPS肝损伤的防护作用

作者：汤新慧, 高静, 陈瑾，徐力致。

【摘要】 　　目的研究中华补血草根提取物（the extract of Limonium sinense Ktze root, LSE）对小鼠急性肝损伤的防护作用及药理机制。方法建立小鼠D氨基半乳糖/脂多糖（DGalN/LPS）肝损伤模型，检测LSE对血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的影响；观察肝脏组织超微结构的变化；测定肝线粒体膜电位以及线粒体对高钙诱发肿胀的敏感性的变化。结果一定剂量（100～400 mg·kg—1）LSE能有效抑制DGalN/LPS引起的小鼠血清AST及ALT活性的显著上升；明显减轻肝损伤引起的小鼠肝脏组织超微结构的破坏；抑制线粒体膜电位的降低以及线粒体对外加高钙诱发肿胀敏感性的下降。结论LSE对DGalN/LPS诱导的急性肝损伤具显著的防护作用，其机理可能与保护肝脏线粒体、抑制肝细胞凋亡有关。 毕业论文。

【关键词】 中华补血草 D—氨基半乳糖/脂多糖 肝损伤 线粒体。

Abstract：ObjectiveTo study the hepatoprotective effect of the extract of Limonium sinense (Girard) Ktze root (LSE) on acute liver injury induced by Dgalactosamine and lipopolysaccharide (DGalN/LPS) and its mechanism. MethodsDGalN/LPS—induced liver injury model was used to evaluate the effect of LSE on the activities of serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in mice. Ultrastructure of liver was observed and liver mitochondrial membrane potential and mitochondrial swelling were measured following DGalN+ LPS injection without or with LSE. Results100 mg·kg—1, 200 mg·kg—1 or 400 mg·kg—1 LSE could significantly inhibit the increase of serum AST and ALT activities induced by DGalN/LPS improve morphological changes in liver and inhibit the decrease of mitochondrial membrane potential and sensitivity of mitochondrial swelling to the exotic Ca2+ stimulation .ConclusionLSE has hepatoprotective activity and the mechanisms may be related to its protection on liver mitochondria.

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Key words：Limonium sinense (Girard) Ktze; D—Galactosamine and Lipopolysaccharide; Liver damage; Mitochondria。

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中华补血草Limonium sinense (Girard) Kuntz，又名匙叶草、盐云草、海菠菜、海赤芍等，为白丹花科补血草属Limonium Mill.多年生泌盐草本植物，喜生于沿海盐渍化的低洼湿地上，广泛分布于我国东北、华北及陕、甘、宁和苏北等地区。除具有较高观赏价值、环境保护等作用外，具有一定药用价值。据记载，该植物具有补血、止血、散淤、调经、益脾、健胃等多种功效，目前临床上主要用于 治疗 功能性子宫出血症，学者们对中华补血草药理作用的研究也主要集中在其抗菌止血方面［1］。成分分析表明，该植物化学成分十分丰富，含有多糖、鞣质、萜类、黄酮类以及氨基酸、矿物质等等［2，3］，推测中华补血草可能具有其它功效。最新的研究初步发现，中华补血草提取物能抑制CCl4及DGalN肝损伤动物血清转氨酶活性的升高［4］，提示该植物可能具有对抗肝损伤作用。然而中华补血草的护肝作用还缺乏全面、深入的研究，其药理机制有待于进一步考察。

本课题拟采用DGalN/LPS小鼠急性肝损伤模型，运用形态学观察，酶活力测定以及线粒体膜电位测定、肿胀敏感性测定等方法，研究中华补血草根提取物对小鼠急性肝损伤的防护作用并探讨其药理机制。 论文网。

1 材料与仪器 论文代写。

1.1 中华补血草根提取物（LSE）的制备中华补血草采集于江苏盐城滩涂，由江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室于延球副教授鉴定。取中华补血草干燥全根100 g，粉碎，用蒸馏水提取1～3次，合并提取液，浓缩、干燥，即得棕色干粉32.9 g（得率32.9 %）。 论文代写。

1.2 动物。

ICR小鼠，雄性，体重18～22 g，购自南京医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2002—0031。

1.3 仪器 论文网。

7520分光光度计，上海分析仪器厂产品； Biofuge Primo R 冷冻离心机，Kendro 公司产品；Hitachi 7600—020全自动生化分析仪、Hitachi 850型荧光分光光度计，日立公司产品； Flexi—DryTM冷冻干燥仪，Stone Ridge公司产品；JEM100CX透射 电子 显微镜，日本电子公司产品。 论文网。

1.4 试剂D 毕业论文。

氨基半乳糖（DGalN），脂多糖（LPS）, 罗丹明（Rh123），甘露醇、蔗糖、EDTA、琥珀酸、鱼藤酮，购自Sigma公司；TrisHCl，Hepes，购自Promega公司。

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2 方法 毕业论文。

2.1 DGalN/LPS急性肝损伤模型的建立 小鼠分5组：正常组；D—GalN/LPS损伤组；100，200，400 mg·kg—1LSE组。正常组和损伤组小鼠以0.2 ml·10 g—1体重生理盐水连续灌胃5 d，LSE各剂量组则分别以不同浓度LSE同样方式灌胃；第6天正常组小鼠按0.2 ml·（10 g）—1腹腔注射生理盐水，其余组小鼠腹腔注射600 mg·kg—1 DGalN；1 h后，除正常组小鼠腹腔注射0.2 ml·（10 g）—1生理盐水外，其它各组腹腔注射LPS（10 mg·kg—1），同时小鼠给予禁食不禁水。LPS注射12 h后，取血，分离血清，待测血清ALT，AST活力。处死小鼠后，取部分肝组织固定，待制备肝组织电镜切片，其余肝组织匀浆，制备肝脏线粒体。

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2.2 酶活力的测定。

论文代写。

分离得到的各组小鼠血清，用全自动生化分析仪测定血清ALT及AST活性。

2.3 形态学观察 代写论文。

所取各组小鼠肝组织，用4%戊二醛溶液中预固定，1 %四氧化锇再固定，制备肝组织电镜切片，透射电子显微镜观察肝细胞超微结构。

2.4 线粒体的制备。

代写论文。

据Apprille法［5］，将肝组织在预冷的分离液（包括225 mmol·L—1甘露醇， 75 mmol·L—1蔗糖， 50 mmol·L—1EDTA，10 mmol·L—1 TrisHCl, pH 7.4）中剪碎，洗净，匀浆，500×g离心5 min，取上清液，8 800×g离心10 min，弃上清液，沉淀即为线粒体，用分离液洗3次，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

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2.5 线粒体膜电位的测定。

按照Emaus法，使用荧光染料罗丹明（Rh123）测定线粒体的膜电位值（DYm）。测定时各处理组小鼠线粒体按0.5 mg·ml—1重悬于测定缓冲液（含225 mmol·L—1 D甘露醇, 70 mmol·L—1蔗糖, 5 mmol·L—1 Hepes, pH 7.2）中，在25℃条件下分别与0.3 mmol·L—1Rh123共孵3 min后，荧光分光光度计测定各组线粒体悬液的荧光强度（激发波长505 nm，发射波长534 nm），并 计算 膜电位的值。计算公式为：DYm=—59 log ［Rh123］in/［Rh123］out［6，7］。

2.6 线粒体肿胀敏感性的测定 论文代写。

线粒体肿胀程度根据线粒体悬液在波长为540 nm 处的吸光值测定。各组小鼠肝脏线粒体按1.0 mg·ml—1重悬于测定缓冲液（125 mmol·L—1蔗糖，50 mmol·L—1KCl，2 mmol·L—1 KH2PO4，5 mmol·L—1琥珀酸，5 mmol·L—1鱼藤酮，10 mmol·L—1Hepes, pH 7.4）中，于30℃条件下，测定各组线粒体悬液加入不同浓度氯化钙后5 min时吸光度的减少值，以此吸光度的减少值作为衡量线粒体肿胀程度的指标，比较各组线粒体诱发相同肿胀程度所需Ca2+浓度，诱发同等程度的肿胀所需的Ca2+浓度越高，表明该线粒体敏感性越低，说明损伤越严重［8，9］。

2.7 统计方法 毕业论文。

进行单因素方差分析（one way analysis of variance, one way ANOVA），各处理组的组间差异采用SNK—q（Student Newman Keuls—q）检验进行比较。显著性水平取a=0.05。 论文代写。

3 结果 代写论文。

3.1 LSE对DGalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤酶活力的影响由图1可看出，DGalN/LPS损伤小鼠的sAST及sALT活性急剧升高（P0.01），而预先以不同剂量LSE灌胃给药的小鼠sAST及sALT活性均显著低于损伤组（P0.01），其中200，400 mg·kg—1 LSE组小鼠sAST及sALT活性已恢复至正常，表明LSE对DGalN/LPS诱发的急性肝损伤有明显对抗作用。 毕业论文。