神经生长因子促进周围神经血管形成的实验研究
作者：李强，伍亚民，申屠刚，徐云钦，李骥，王刚。
【摘要】 [目的]探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在大鼠坐骨神经再生过程中促进血管形成的作用。[方法]利用自行研制的梭形双通道桥接管桥接36只SD大鼠坐骨神经长10 mm缺损。将动物随机分为2组，A组：医用几丁糖凝胶组;B组：医用几丁糖凝胶+NGF和医用几丁糖凝胶+睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)。术后4、8、16周观察再生神经的大体形态，并用HE染色和透射电镜观察再生神经的束间及束内血管分布。[结果]A组2支管内再生神经大体观察无明显差异，B组NGF侧再生神经外观呈粉红色或淡红色，质脆，弹性差;CNTF侧再生神经呈淡黄性，质韧，弹性佳。HE染色见NGF侧再生神经较CNTF侧再生神经排列紊乱，其束间及束内的血管较多见;超微结构示：B组NGF侧再生神经较少，但可见较多的成纤维细胞和丰富的新生血管。[结论]虽然NGF对周围神经再生的促进作用不及CNTF，但其在神经再生的早、中、晚期均具有较为明显的血管形成作用，其作用机制可能与成纤维细胞增殖密切相关。
【关键词】 梭形双通道桥接管; 神经生长因子; 周围神经再生; 血管形成。
Abstract：[Objective]To discuss the effects of angiogenesis about nerve growth factor(NGF) during the peripheral nerve regeneration.[Method]Thirtysix SpragueDawley rats with 10mm gap of sciatic nerve were randomly divided into two groups which had been bridged with the new double channel nerve conduit of fusiform shape.Each group contained eighteen animals,in the first group,200 μl of chitin for medical use was injected into the conduit,in the second group,the two branches of the conduit contained 100 μl of the chitin and 5 μl NGF or ciliary neurotrophic factor(CNTF).At four,eight or sixteen week after operation,the angiogenesis of NGF was evaluated with Hematoxylin and Eosin(HE) staining and electron microscope.[Result]There were not significant differences of the regenerative nerve fibres between two channels in the first groups,but in the second group,the regenerative nerve of NGF branch channel was red,crisp and the nerve of CNTF branch channel was yellow and tenacious.HE staining showed that there were much more new vessel in the regernerative nerve tract of NGF the branch channel,and the regernerative nerve fibre was disorder,there were much more fibroblasts and vessels observed under eletron microscope.[Conclusion]NGF can significantly promote the angiogenesis during the peripheral nerve regeneration,the mechanism may be related to fibroblast.
Key words：double channel nerve conduit of fusiform shape; nerve growth factor; peripheral nerve regeneration; angiogenesis。
神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)是最早被发现，且研究较深入的神经营养因子，其对神经系统发育、维持神经元存活和神经损伤后的修复均有重要作用。近年来研究还发现NGF可通过增加血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，促进血管内皮细胞增殖和迁移，在缺血组织、角膜、脉络膜和虹膜的血管形成过程中发挥重要作用。本研究通过应用新型的神经再生小室模型观察到NGF在周围神经再生过程中具有较为明显的血管形成作用，现报告如下。
1 材料与方法。
1.1 动物手术与实验分组。
选取健康成年清洁级SD大鼠36只，雌雄不拘，体重200～250 g，平均229 g(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所动物中心提供)。10 g/L戊巴比妥钠按30 mg/kg腹腔内注射麻醉。侧卧位，剃毛、消毒后，取股后斜切口，暴露右侧坐骨神经，10倍手术显微镜下游离坐骨神经，并在梨状肌出口下方5 mm处将坐骨神经切除约8 mm，任其回缩，造成10 mm缺损，用自行研制的梭形双通道乳胶管[1]桥接神经缺损段，用10—0无损伤显微缝合线将神经远、近断端与桥接管缝合固定2针。缝合方法采用两定点套接法：即分别在神经干周径180°两相对位置各缝合1针，使得再生神经断端套入桥接管内，并距2支管的分叉处约1 mm。根据梭形管2支管内加入的药物不同将动物随机分两组，每组每个时间点6只动物。A组：2支管内分别注入医用几丁糖凝胶100 μl(上海其胜生物制剂有限公司);B组：2支管内注入医用几丁糖凝胶100 μl后，再用微量注射器分别将5 μl NGF(20 ng/μl，美国Sigma公司)和5 μl睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)(60 ng/μl，美国Sigma公司)注入到2支管的中段，用0—0丝线将桥接管缝合固定在邻近的软组织上，逐层缝合肌膜和皮肤切口，在统一标准条件下分笼饲养。
1.2.1 一般观察 分别于术后4、8、16周将大鼠再次麻醉，沿原皮肤瘢痕切开皮肤及皮下组织，显露桥接管，观察梭形双通道乳胶管有无移位、变形、塌陷及裂开，并纵向剖开桥接管，观察梭形双通道乳胶管的2支管内再生神经的颜色、质地、弹性、粗细等。
1.2.2 组织病理学观察 于术后8、16周将大鼠麻醉后，剪开胸腔，左心室主动脉插管，剪开右心耳。快速灌入生理盐水150～200 ml，待流出液体清亮后，灌注40 g/L多聚甲醛约200 ml。固定2 h后取再生神经放入40 g/L多聚甲醛中继续固定。然后将标本常规脱水、透明、浸蜡、包埋后行石蜡切片，切片方法分为纵切和横切，片厚5 μm，HE染色，观察2支管内再生神经形态学特征和神经纤维束间和束内的血管分布情况。
1.2.3 超微结构观察 术后4、8周将动物麻醉、固定后，剪开胸腔、左心室插管，剪开右心耳。快速灌入生理盐水150～200 ml，待流出液体清亮后，灌注40 g/L多聚甲醛约200 ml。取2支管内再生神经的中段用4%戊二醛及1%四氧化锇(磷酸盐配制)作预固定和后固定(pH 7.2～7.4)各2 h，酒精及丙酮逐级脱水，采用环氧树脂618定向包埋，用ReichertJung超薄切片机作0.5 μm厚半薄切片，经1%甲苯胺蓝—天青Ⅱ染色后在光镜下定位，制备超薄切片，用醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，在Hitachi—600透射电镜下观察再生神经轴突形态及血管密度与分布。
2 结 果。
2.1 一般观察。
术后4周，桥接管周围为膜状组织所包绕，无裂口、变形、变薄、变色、移位和塌陷。剖开桥接管，管内两断端神经向前延伸，A组6只大鼠有2只可见再生神经断端呈吻合状，另4只仅呈芽状再生，且2支管内再生神经大体形态无显著性差异;B组6只大鼠CNTF侧神经再生成功有5只，另1只呈芽状再生;NGF侧神经再生成功仅2只，另4只呈芽状再生，但再生神经纤细，呈橘红色或粉红色，粗细欠均匀，质脆，CNTF侧再生神经呈淡黄色，粗细均匀，质韧，弹性好。至术后8周，桥接管无移位变形，剖开桥接管观察再生神经，A组桥接管内再生神经呈淡黄色，粗细、弹性均无明显差别，B组6只动物的CNTF侧再生神经均呈淡黄色，粗细均匀，质韧，弹性好，NGF侧再生神经4只呈粉红色，2只呈橘红色，表面欠光滑，粗细欠均匀、质脆、弹性差(图1)。至术后16周，桥接管无裂口、移位和塌陷，表面仍为膜状组织，肉眼可见新生血管稍较多。桥接管内再生神经均变粗，A组内再生神经呈淡黄色，粗细、弹性均无明显差别。B侧NGF侧再生纤维外观5只呈淡红色，1只呈橘红色，质嫩，弹性差，而CNTF侧再生神经均呈淡黄色，质韧、弹性佳。