反相高效液相色谱法同时测定马鞭草中乌索酸和齐墩果酸的含量
【摘要】 目的建立RP—HPLC法测定马鞭草中乌索酸和齐墩果酸的含量。方法色谱柱为Nucleosil C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），流动相为甲醇—水(88∶12, V/V)，流速为0.8 ml/min，检测波长为210 nm，柱温25℃。结果乌索酸在0.458～4.109 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7)，平均回收率为98.1 %，RSD=1.1%；齐墩果酸在0.156～1.389 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 6)，平均回收率为101.7%，RSD=1.7%。结论方法快速简便、准确可靠，可作为马鞭草药材的质量控制方法。
Abstract：ObjectiveTo establish a method for determining ursolic acid and oleanolic acid in Verbena officinalis L. by high performance liquid chromatography. MethodsThe separation was carried out on Nucleosil C18 column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) with methanol—water (88∶12,V/V) as the mobile phase.The flow rate was 0.8 ml/min and the detection wavelength was 210nm. The column was used at 25℃. ResultsUrsolic acid showed a good linear relationship in the range of 0.458～4.109 μg (r=0.999 7) and the average recovery was 98.1%. RSD was 1.1%. Oleanolic acid showed a good linear relationship in the range of 0.156～1.389μg (r=0.999 6) and the average recovery was 101.7%. RSD was 1.7%. ConclusionThe method is rapid, simple, accurate and reliable and can be used for the quality control of Verbena officinalis L.．。
Key words：Verbena officinalis L.；Ursolic acid；Oleanolic acid；RP—HPLC 马鞭草为马鞭草科植物马鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分，又名铁马鞭、疟马鞭、土荆芥。马鞭草为传统中药，具有清热解毒、活血散淤、利水消肿等功效，可用于治疗疟疾、白喉、传染性肝炎、流行性感冒等［1］。马鞭草含马鞭草苷、5—羟基马鞭草苷、熊果酸、挥发油等多种化合物［2］。现代药理研究表明，乌索酸（熊果酸，Ursolic acid）具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌及增强免疫功能等多种药理活性，具有重要的药用开发价值［3］。本实验采用RP—HPLC法同时测定了马鞭草中乌索酸和齐墩果酸的含量，为控制药材质量提供科学依据。
1 器材。
1.1 仪器。
Waters515双泵型高效液相色谱仪（2996光电二极管矩阵检测器，77251进样阀，20 μl定量环，Empower中文色谱工作站，美国Waters公司）；RO—MB—10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP225D电子分析天平（德国Sartorius公司）；202—26A型数显电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；KS—1500超声提取仪器 (宁波科盛仪器厂)。
1.2 材料。
马鞭草购于江西省宜春市药材市场，经江西省天然药物活性成分研究重点实验室鉴定为马鞭草科植物马鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分。
甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂），水为高纯水，95%乙醇(分析纯，江西同盟试剂化工厂)，乌索酸和齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：110742—200516，110709—200511）。
2 方法与结果。
2.1 色谱条件色谱柱为Nucleosil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μl, 带保护柱)；流动相为甲醇—水（88∶12，V/V）；流速为0.8 ml/min；柱温为25 ℃；检测波长为210 nm；以《美国药典》方法计算，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于10 000。乌索酸和齐墩果酸对照品及马鞭草样品的HPLC色谱见图1。
2.2 对照品溶液的配制精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品 22.8 mg 和齐墩果酸对照品 7.8 mg ，置于 10 ml 容量瓶中，加入适量甲醇溶解，用甲醇定容，得对照品储备液。精密吸取1 ml混合液置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混合均匀，制成乌索酸和齐墩果酸的浓度分别为 0.228 μg/μl 和 0.078 μg/μl 对照品混合溶液，备用。
2.3 样品溶液的制备将马鞭草样品置烘箱中 85℃ 烘干12 h，研细后精密称取约 4 g ，置于具塞三角烧瓶中，加入 10 倍量 95% 乙醇，采用超声法提取 60 min ，过滤，药渣洗涤两次，合并滤液于 50 ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。滤液用 0.2 μm 的滤膜过滤，得马鞭草提取物的样品溶液。