应用细胞内PCR技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库
作者：刘玲，田艳丽，李春英，高天文。
Construction and screening of human vitiligo phage autoantibody library based on incell PCR。
【Abstract】 AIM: To obtain in situ pairing of the variable region genes of the heavy and light chains of vitiligo patients lymphocytes, then construct and screen a human ScFv phage antibody library. METHODS: We amplified in situ pairing of the variable region genes of the immunoglobulin heavy and light chains using the incell PCR together with Crerecombination, constructed and panned a human ScFv phage antibody library, and screened it with pigment cell suspension, then detected the activity of positive clones. RESULTS: We constructed an antibody library of 3×l06 in size, and obtained one specific autoantibody against melanocyte membrane antigens. CONCLUSION: Incell PCR together with human phage antibody library may be useful tools for the study of vitiligo antibody gene family and the VH/VL pairing that occurs during the autoimmune process.
【Keywords】 vitiligo; polymerase chain reaction; phage antibody library; autoantibodies。
【摘要】 目的： 克隆白癜风患者淋巴细胞中原始配对的自身抗体基因，构建噬菌体抗体库并筛选针对黑素细胞膜抗原的特异性抗体. 方法： 细胞内PCR法扩增人免疫球蛋白轻链和重链可变区基因，Cre重组酶介导下完成单个细胞内的轻重链连接，获得反映体内原始配对信息的单链抗体可变区基因，构建噬菌体抗体库，筛选针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结果： 构建完成库容量约为3×l06的噬菌体抗体库，筛选得到1株针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结论： 利用细胞内PCR技术和噬菌体抗体库技术成功构建免疫文库，为进一步研究自身抗体在白癜风发生发展过程中的作用奠定了基础.
0引言。
白癜风是一种常见的皮肤色素脱失性疾病，病因尚未完全明确，近年的研究倾向于自身免疫在黑素细胞破坏中发挥了重要作用. 患者体内存在包括抗黑素细胞抗体在内的多种自身抗体［1］. 抗黑素细胞抗体针对多种黑素细胞成分，其滴度与疾病活动性平行［2］，部分抗体针对细胞膜抗原，在黑素细胞破坏中有重要作用. 我们在前面的实验中已经摸索出细胞内PCR扩增抗体基因的方法，成功扩增患者体内原始亲本配对的自身抗体基因［3］，进一步结合噬菌体抗体库技术，构建免疫文库并筛选针对黑素细胞膜抗原的自身抗体，为研究血清中抗体对黑素细胞的作用奠定了基础.
1材料和方法。
1.1样本白癜风患者均来自西京医院皮肤科门诊，诊断依据白癜风临床分型及疗效标准（2003修订稿）［4］，选择进展期、面积较大（皮损面积占体表面积5%以上）的患者，其中男48例，女52例；年龄12~55（平均21）岁；平均病程2 mo；所有患者采血前3 mo内未接受皮质类固醇、免疫调节药物、光化学等系统治疗. 1.2试剂免疫磁珠，CD19+单抗（BD Pharmingen公司），辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG和HRP标记羊抗鼠IgG（武汉博士德生物制品公司），蛋白酶K（Merck kGaA公司），PCR引物由赛百盛公司合成，Trizol和逆转录酶SuperScriptⅢ（Invitrogen公司），Cre重组酶（纽英伦生物公司），Taq酶和PCR产物回收纯化试剂盒（TaKaRa公司），限制性内切酶和T4 DNA连接酶（Promega公司），噬菌体表达载体PHENI由本校生化教研室雷迎峰博士惠赠，大肠杆菌XLBlue和含卡那霉素抗性的辅助噬菌体VCSM13由本实验室常规保存. 1.3扩增体内亲本配对的抗体基因。
1.3.1分离CD19+B淋巴细胞常规培养人黑素细胞，活细胞ELISA法［5］筛选强阳性血清，抽取相应静脉血各15 mL,用淋巴细胞分离液按常规方法分离外周血单核细胞，免疫磁珠分离收集CD19+B淋巴细胞. 1.3.2扩增抗体基因按文献［3］扩增人类主要的轻重链可变区基因，所有引物序列：5′GCTGCTGAGGGAGTAGAG 3′, 5′CAGATTTCAACTGCTCATCAGATGG 3′, 5′ATGGACTGGACCTGGAGGRTCYTCTKC 3′, 5′ATGGAGYTTGGGCTGASCTGGSTTTYT 3′, 5′TCATTCTCGACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAA GTTATAGAGCCGCCGCCGCCACTGCCGCCACCACCTGARGAGACRGTGACCRKKGTBCC 3′, 5′CTCGCAACTGCATAACTTCGTGCCATGGCCGMCATCCRGWTGACCCAGTCTCC 3′, 5′CTCGCAACTGCATAACTTCGTGCCATGGCCGATATTGTGATGACYCAGWCTCC 3′,5′CTCGCAACTGCATAACTTCGTGCCATGGCCGAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC 3′, 5′GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTTGGCCCAGGTGCAGCTGSWGSAGTCWGG 3′, 5′GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC 3′, 5′GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCGTTTGATATCCACTTTGGTCCC 3′, 5′GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTCGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC C 3′, 5′CAGATTT CAACTGCTCATCAGATGG 3′.（SfiI位点CCG GCC TTG GCC；NotI位点TGC GGC CGC. 引物中的简并碱基符号K=G/T, M=A/C, R=A/G, S=C/G, W=A/T, Y=C/T, B=C/G/T, D=A/G/T, H=A/C/T, V=A/C/G）. PCR1反转录、分别扩增轻链和重链可变区基因，Cre酶重组后PCR2及PCR3扩增反映体内原始装配的抗体基因，各步PCR反应条件均优化为95℃ 30 s, 57℃ 40 s, 72℃ 1 min. 1.4构建ScFv噬菌体抗体库纯化的ScFv基因产物，经SfiI和NotI双酶切，与同样双酶切回收的PHENI载体大片段连接，电转化XLBlue感受态菌，37 ℃ 100 r/min振荡1 h，取适量菌液铺于Amp阳性的LB琼脂平板，37℃数菌落计算库容，并挑单菌落提取质粒，酶切鉴定抗体库的重组率. 其余菌液转入含氨苄青霉素(100 mg/L)的SB培养液，37℃振荡1 h，加入四环素(10 mg/L), 37℃振荡1 h，按1×l012 cfu/mL加入辅助噬菌体VCSM13, 37℃振荡2 h后加入卡那霉素(70 mg/L), 37℃振荡过夜. 次日，收集菌液4℃ 5000 r/min离心15 min，收集上清，加PEG8000至40 g/L, NaCl至30 g/L，冰浴中沉淀30 min, 4℃ 8000 r/min离心30 min，弃上清，10 g/L BSA 10 g/L甘油PBS溶解沉淀，12 000 r/min离心，上清即为噬菌体抗体库，—20℃保存. 1.5筛选噬菌体抗体库参照文献［6］，以完整的黑素细胞为抗原对噬菌体抗体库进行4轮富集筛选. 2×107个细胞洗涤离心，30 g/L BSAPBS 1 mL, 37℃封闭1 h，弃封闭液，加噬菌体抗体库液1 mL, 37℃缓慢颠倒吸附2 h. 离心弃上清，PBS洗涤（第一轮洗2次，以后每轮洗20次），加入对数期生长的XLBlue菌液2 mL, 37℃振荡培养30 min，取适量铺盘计算回收率，其余转入三角烧瓶，加SB至总体积10 mL，37℃振荡培养1 h，加入70 mL SB培养液和AMP（100 mg/L），于37℃振荡培养至对数生长期；加1×l012 cfu VCSM13诱导表达，30℃振荡培养过夜. 次日将菌液离心收集上清，浓缩后得到次级库，反复筛选4轮. 1.6噬菌体抗体的表达和特异性检测。
1.6.1噬菌体抗体的表达从第3轮和第4轮筛选后的培养皿上分别随机挑取40个菌落各加入到1.5 mL LB培养液中(Amp 100 mg/L, Kan 25 mg/L)中，37℃振荡培养过夜. 补加1.5 mL LB，振荡培养1 h，加入50 μL VCSM13，30℃振荡培养过夜. 次日，菌液离心上清即为初步筛得的噬菌体抗体.