SD大鼠脊髓中NT—3及其受体TrkC的原位分布

作者：钱东翔 张洪钿 罗鹏 郭炜 王智坚 李珺 秦玲莎。

【摘要】目的 通过免疫组化染色的方法研究成年SD大鼠脊髓中NT—3及其受体TrkC的原位分布和亚细胞定位，探讨内源性NT—3的作用机制。方法 以健康成年SD大鼠为实验动物，取脊髓各节段的运动神经元组织标本作免疫组化染色，以了解NT—3及TrkC的原位分布和亚细胞定位。结果 观察到不同强度的NT—3及TrkC免疫阳性产物广泛分布于大鼠脊髓的运动神经元、中间神经元和胶质细胞。NT—3定位于胞浆和胞核，胞核染色明显，强于胞浆和神经纤维。TrkC主要定位于阳性细胞的胞浆内，极少出现在树突或神经末梢上。结论 NT—3及TrkC在成年SD大鼠脊髓的运动神经元有差异性表达，提示二者均参与了大鼠脊髓神经细胞的生理功能，但在不同区域又发挥着不同的作用。 【关键字】神经营养因子 NT—3 TrkC 免疫组织化学 分布 神经营养因子（Neurotrophic factors ,NTFs）是能促进神经元存活，诱导其分化，并对神经系统的发育及功能的维持起作用的一类多肽[1]。至今，已发现的NTFs不下20余种。NT—3是迄今为止发现的，在动物发育过程中表达最强的神经营养因子[2]。NTFs的成员不仅可促进神经细胞存活，刺激轴突生长，调节突轴可塑性和神经传递，在神经细胞的生长、发育、分化及功能维持中发挥作用，而且可以促进损伤神经元的修复和再生，从而减轻脑或脊髓损伤后继发性损害的程度，因此在神经损伤修复过程中起着重要作用[3—6]。所以，各国神经科学家在这一领域广泛地开展研究。即便如此，在体内，内源性的NT—3在不同种类的神经细胞发挥怎样的生理作用及其作用模式目前尚不清楚。绝大多数是NTFs参与神经组织损伤的相关性研究，例如应用外源性NTFs促进神经功能修复等，而要澄清NTFs在CNS不同部位、不同神经元群间的转运模式和作用机制，必须深入了解NTFs蛋白在CNS的区域分布和亚细胞定位。本实验拟通过免疫组化染色的方法研究成年SD大鼠脊髓运动神经元中NT—3的原位分布和亚细胞定位，探讨内源性NT—3的作用机制。

1 材料与方法 1.1实验动物 实验用SD大鼠，体重200～220克，微生物等级为SPF级，均为雌性，饲养温度20～24℃，正常饮食，自由饮水。购自广东省医学实验动物中心，经广东省实验动物监测所检验检疫符合实验动物标准，许可证号为：SCXK(粤)2003－0002 粤监证字2008A020。 1.2实验试剂 兔抗NT—3多克隆抗体（Millipore，效价1:1000）、鼠抗TrkC单克隆抗体（Millipore，效价1:3000）、SP三步法试剂合、浓缩型DAB 试剂合、荧光二抗试剂、免疫组化常规试剂等。 1.3免疫组化取材 将待取材大鼠过量麻醉，用4%多聚甲醛心内灌注固定，取双侧颈髓、胸髓、腰髓三个部位的各两小节段脊髓组织。后固定后作梯度浓度蔗糖脱水，再作连续切片制作标本玻片，用NT—3及TrkC抗体行免疫组织化学染色。 2 结果 2.1 NT—3在SD大鼠脊髓中的分布及亚细胞定位 2.1.1脊髓灰质 在脊髓灰质腹角，可见NT—3免疫阳性神经元，以大运动神经元为主，特别是Ⅷ、IX板层染色明显（图1）。在灰质背角的Ⅰ、Ⅱ板层，可见毛刷状的NT—3免疫阳性神经元，但染色较弱。在中央管附近的Clarke核（Clarke nucleus，CN）可见NT—3强阳性染色的神经元。 图1 NT—3在正常成年SD大鼠脊髓腹角阳性运动神经元的免疫组化染色×200 2.1.2脊髓白质 在整个白质区的横断面上，可见弱阳性的NT—3免疫阳性纤维和细胞，从形态上判断，细胞形似星状胶质细胞和小胶质细胞。 2.1.3亚细胞定位 在胞浆和胞核均可观察到NT—3免疫阳性产物，胞核染色非常明显，比胞浆染色更强，少量阳性神经纤维着色。 2.2 TrkC在SD大鼠脊髓中的分布及亚细胞定位 在正常的脊髓中，TrkC的免疫阳性产物被检测到在运动神经元和中间神经元中均有表达。TrkC的亚细胞定位主要是位于阳性细胞的胞浆内，极少出现在树突或神经末梢上（图2）。在白质内被GFAP标记的星型胶质细胞也同样可见TrkC抗体的阳性表达。 图2 TrkC在正常成年SD大鼠脊髓前角运动神经元的免疫组化染色×300。