反相高效液相色谱法测定全血中环孢素A的浓度
作者： 张卫东，王国团，朱春梅。
［摘要］目的: 建立检测患者全血中环孢素A（CsA）浓度的高效液相色谱法。 方法: 血样经乙醚—石油醚（70∶30）萃取后，以C 18 硅胶键合相为固定相，乙腈—甲醇（80∶20）为流动相，70℃柱温下进行色谱分析，紫外检测波长为210nm。 结果: CsA全血浓度在50～1600ng.mL范围内呈良好的线性关系，r=0.9998，方法的平均回收率为97.6%，日内和日间精密度RSD均小于6%（n=5），最低检测限为10ng.mL。 结论: 本法简便、快速，易于开展，用于肾移植术后患者CsA的血药浓度监测，效果良好。
Determination of cyclosporin A in human whole blood by RP—HPLC。
18 column and a mobile phase of acetonitrile—methanol（80∶20）.The column temperature was maintained at70℃and CsA was detected at210nm.Results:A good linear relationship was obtained between the con—centration of CsA from50ng.mL to1600ng.mL，r=0.9998.The average recovery rate of CsA was97.6%，and the RSD within a day and be—tween days were less than6%（n=5）.The detection limit of CsA was10ng.mL.Conclusions:The established method was accurate，simple，sensitive and suitable for the therapeutic monitoring of CsA.
［Key words］RP—HPLC;Cyclosporin A;Therapeutic drug monitoring。
环孢素A（Cyclosporin A，CsA）是一种选择性的免疫抑制剂，广泛用于器官移植疾病及其它疾病治疗［1，2］ 。由于CsA体内过程的个体差异较大，其血药浓度过高或过低都会引起毒副反应，因此在患者治疗过程中需常规监测血药浓度，从而提高移植器官或组织的存活率并降低对肾脏和肝脏的毒副作用［3］ 。目前国内外测定全血中CsA的方法主要有荧光偏振免疫法（FPIA）和高效液相色谱法。FPIA法因简便、快速而受到临床欢迎，但其测定成本昂贵，且该法易受代谢产物等因素的干扰，使测定结果偏高;HPLC法有固相萃取法和液—液多步萃取法 ［4、5］ ，操作较繁琐，但成本较低。为此，本文建立了一种简便可行的RP—HPLC法测定CsA全血浓度，用于肾移植术后患者CsA血药浓度监测，效果良好。
1 材料和方法。
1.1 仪器。
高效液相色谱仪（美国Waters公司，510型泵，486型紫外检测器）;色谱柱恒温箱（天津金州科学仪器公司，AT—130），快速混匀器（江西医疗仪器厂，YHK型）;台式离心机（上海安亭科学仪器厂，KDC—16H）;微量分析天平（美国TG322A）。
1.2 试剂与药品。
CsA和CsD标准品（中国药品生物制品检定所，0668—0203、0669—0206），乙腈、甲醇为色谱纯（美国Dik—mapure，20050318、20050116），其他试剂为分析纯。
1.3 标准溶液的配制。
精密称取CsA标准品8mg，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶（80μg.ml）得贮备液，保存于—20℃冰箱中。精密称取CsD标准品5mg，用甲醇定容至100mL容量瓶中，配制成贮备液，取CsD储备液4mL用甲醇稀释至100mL容量瓶，配制成2000ng.mL的内标工作液。
1.4 色谱条件。
固定相:Nova—Pak C 18 柱（4μm，3.9mm×150mm）（美国Waters仪器公司），柱温:70℃;流动相:乙腈—水（80∶20），流速:0.8mL.min;检测波长:210nm;灵敏度:0.005AUFS。
1.5 样品处理。
0.5mL血样中加100μL内标工作液，旋涡混匀后，加入150μL250mmol.L的氢氧化钠液，旋涡混匀后置45～50℃水浴孵育约5min破坏RBC，再混匀后，加3mL石油醚—乙醚（70∶30），旋涡提取8min，3000r.min离心3min，分离有机层于尖底试管，于45～50℃水浴通氮气吹干，再加300μL甲醇溶解后，分别用1mL正己烷—正庚烷（50∶50）反萃取两次后，1500r.min离心3min后吸弃上层液，于45～50℃水浴通氮气吹干，残渣用50μL甲醇充分溶解，按“色谱条件”项下条件进样 20μL分析。
2 结果。
2.1 方法可行性。
在所选色谱条件下，CsA及内标CsD能较好的分离（CsA、CsD的保留时间分别为7.25min、9.30min），分离度R=1.602，色谱峰与内源性杂峰分离良好，易准确定量。色谱图见图1。 A:空白血样 B:空白血样+CsA C:空白血样+内标 D:空白血样+CsA+内标 E:患者血样图1 血液中环孢素A的HPLC图（1—CsA 2—内标）。