HPLC—MS/MS测定小鼠组织中氧化苦参碱和苦参碱含量
作者：陈有军，刘奕明，赵瑞芝，刘丽娟。
【摘要】 目的建立HPLC—MS/MS测定小鼠肝、心、脾、肺、肾组织中氧化苦参碱和苦参碱浓度的方法。方法利用肝脏组织进行了提取方法的研究，考察了提取溶剂、提取温度、匀浆配比等对氧化苦参碱提取回收率的影响;测定以非那雄胺为内标,用电喷雾离子化和正离子多离子反应监测方式检测氧化苦参碱和苦参碱。结果组织—水为1∶10，在冰水浴中匀浆，以2%正丁醇氯仿混合溶剂的液—液萃取法处理样品;氧化苦参碱和苦参碱线性范围均为42 000 ng·ml—1;定量下限均为4 ng·ml—1;各组织方法回收率均在87.1%110.3%;批内、批间精密度14%;提取回收率58.6%。结论该含量测定方法准确、灵敏、简便、省时，适用于小鼠各脏组织中氧化苦参碱和苦参碱的含量测定。
【关键词】 氧化苦参碱; 苦参碱; HPLC—MS/MS; 组织。
Abstract：ObjectiveTo establish LC—MS/MS method for determination of oxymatrine and matrine in liver, heart, spleen, lung and kidney of rats.MethodsExtraction method was studied using rat liver, and the effect of solvent, temperature and the proportion of tissues—water on extraction efficacy of oxymatrine recoveries were investigated. Finasteride as an internal standard gas—auxiliary electrospray ionization source, oxymatrine and matrine were detected by the positive electrospray ionization (ESI)—MS method under multiple reaction monitor (MRM) mode. Results Tissues were homogenated in ice water bath with the tissue—water proportion of 1:10, extracted by 2% n—butanol and trichlormethane. The linearity of both oxymatrine and matrine ranged from 4 to 2000 ng·ml—1 ,the detection limits of them was 4ng·ml—1.The recovery of this method ranged from 87.1%110.3%.The values of RSD within day and between days were less than 14%. Mean recovery rates were more than 58.6%. ConclusionThis method is accurate，highly sensitive,simple and convenient, time saving for the simultaneous determination of oxymatrine and matrine concentrations in tissue of rats.
Key words：Oxymatrine; Matrine; HPLC—MS/MS; Tissue。
氧化苦参碱(oxymatrine OMT)和苦参碱(matrine MT)是中药苦参中的主要活性成分，氧化苦参碱给药后，体内主要代谢为苦参碱[13]。两者均有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗风湿、抗病毒、抗寄生虫、抗心律失常等作用[4]。尽管关于氧化苦参碱与苦参碱分析方法的报道很多，但基本都是血液或体外样品含量测定，关于组织内两种成分同时测定还未见报道。组织成分复杂，有酶等多种生物活性物质存在，对氧化苦参碱有代谢作用，从而影响其含量测定，因此本文选择了药物主要代谢组织肝脏作为提取方法研究的对象，通过对提取溶剂、提取温度和匀浆配比等的考察，建立了稳定性好、专属性强、灵敏度高的HPLC—MS/MS同时测定小鼠脏器组织中氧化苦参碱和苦参碱含量的方法，对于氧化苦参碱体内分布及代谢研究等都有重要意义。
1 材料与仪器。
1.1 动物广州中医药大学实验动物中心提供雄性KM小鼠[动物合格证号：SCXK (粤) 2003—0001]，体质量1822 g。
1.2 试剂与药品氧化苦参碱(陕西一星生物制品有限公司);苦参碱(中国药品生物制品检定所，含量大于98%);非那雄胺(重庆万利康制药有限公司);氯仿、正丁醇(AR，天津市富宇精细化工有限公司);甲醇(HPLC 级，KYUNGKIDO公司 韩国);乙酸铵(HPLC级，Tedia公司，美国);纯化水为自制纯净水。
1.3 仪器API3000型液相色谱—三级四极杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源(ESI)，(AB公司，美国); 1100液相色谱系统，美国Agilent公司产品;超低温冰箱(NEW BRUNSWICK 英国);电子天平(BS224 S 北京赛多利斯仪器系统有限公司);IKA涡漩震荡仪(GENIUS 3)和IKA匀浆仪(T10)均为德国IKA制造;白洋台式离心机(G 20 河北省安新县白洋离心机厂);自制水浴空气吹干仪。
2 方法。
2.1 色谱条件色谱柱为(Interlsil ODS—SP,5 μm，2.1 mm×150 mm);流动相为甲醇—10 mmol·L—1乙酸铵溶液(乙酸调pH值3.5)(80∶20);流速300 μl·min—1 ;柱温为室温;进样10μl。
2.2 质谱条件电喷雾ESI源;喷雾电压IS为4 500 V;雾化温度450℃;雾化气NEB(GAS1)为12 L·min—1;加热辅助气AUX(GAS2)为6.5 L·min—1;帘气CUR为9 L·min—1;碰撞气CAD 6 L·min—1;检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的母子离子对分别为氧化苦参碱(m/z265.3→247.2);苦参碱(m/z249.5→148.2)和内标物非那雄胺(m/z373.5→305.6)。见图13。
2.3 标准品溶液及内标液的配制 精密称取氧化苦参碱和苦参碱适量，用水溶解并稀释成1 mg·ml—1的混合溶液作储备液;同法配制质控样品储备液;精密称取非那雄胺适量，用甲醇溶解并稀释成0.5 μg·ml—1溶液作内标液。
2.4 组织样品采集将空白动物摘眼球采血后处死，立即取心、肺、肝、肾、脾等组织，用生理盐水洗去组织表面的残血，以滤纸拭干，置—80℃保存待处理。
2.5 样品处理。