形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析
【摘要】 目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法:采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM—T Easy载体，转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定，并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列，测序结果表明，获得的弓形虫NTPase—Ⅱ基因全长1 812 bp，编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase—Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase—Ⅱ基因，为其相关研究奠定了基础。
Abstract: Objective:To clone and analyze the nucleoside triphosphate hydrolase (NTPase) gene of Toxoplasma gondii. Methods: The NTPase gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from RH strain of Toxoplasma gondii and cloned into pGEM—T Easy vector. Positive clones were screened and identified by BglⅡ、HindⅢ digestion and sequenced. The DNA sequence and its deduced protein sequence were analyzed. Results: The NTPase gene was specifically amplified, DNA sequence analysis showed that the length of cloned gene was 1 812 base pair. The homology of this deduced amino acids sequence was 100% to that in the Genebank. Conclusion: The NTPase—Ⅱ gene is successfully cloned, providing basis for the future research about this gene.
Key words: Toxoplasma gondii; NTPase; cloning; sequencing。
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生的机会致病性原虫，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶（nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase）为分布于弓形虫速殖子表面一种主要特异性抗原[1，2]，其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用[3]。目前，国内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究主要集中在P30（SAG1）和P22抗原[4—6]，而对NTPase的研究鲜见报道。因此，我们对弓形虫RH株的NTPase基因进行扩增与克隆，为下一步的研究奠定基础。
1 材料和方法。
1.1 虫株和试剂 弓形虫RH株由浙江省医学科学研究院寄生虫病研究所惠赠；E.coli DH5α为本室保存；pGEM—T Easy载体购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司；限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产品；2×PCR Master Mix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司；200 bp Marker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程技术有限公司产品。
1.2 模板DNA制备 弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3 d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液，800 r/min离心8 min后加速至2 000 r/min离心10 min，收集中层虫体[7]，按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。
1.3 PCR扩增 根据弓形虫NTPase参考核苷酸序列[8]和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，采用Primer Designer引物设计软件自行设计引物，由上海基康生物技术公司合成，引物序列如下：上游引物：5‘—GAAGATCTACAGACTCATCGTCACT CCG—3‘（下划线为BglⅡ酶切位点），下游引物：5‘—GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC—3‘（下划线为HindⅢ酶切位点）。采用2×PCR Master Mix试剂盒扩增NTPase基因，PCR反应总体积为50μl：其中含有模板DNA 5μl（200 ng），上下游引物各1μl（终浓度为0.4μmol/L）。同时设立空白对照。PCR反应参数：95 ℃ 5 min×1；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s×30；72 ℃ 10 min×1。1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。
1.4 T—A克隆及测序 回收的PCR产物与pGEM—T Easy载体16 ℃过夜连接。连接体系为10μl：纯化的PCR产物3μl，2×buffer 5μl，pGEM—T Easy Vector 1μl，T4 DNA连接酶1μl。连接产物转化感受态E.coli DH5α，吸取200μl转化后的感受态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，筛选阳性克隆。阳性重组子经培养和提取质粒后，分别进行BglⅡ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定，并送上海基康生物技术公司测序。测序结果采用DNAMAN软件与Genebank公布的弓形虫NTPase基因[9]序列进行比较，并推导其编码的氨基酸序列。对获得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守功能域、二级结构等进行生物信息学分析。
2 结果。
2.1 PCR扩增结果 从弓形虫RH株DNA模板中扩增获得预期大小（1 812 bp）的目的条带（见图1）。
2.2.1 物理化学性质预测：测定的弓形虫NTPase编码区基因长1 812 bp，A+T含量为47.8%，G+C含量为52.2%，预测编码603个氨基酸，理论等电点为5.72，Mr为66 900，其中含80个碱性氨基酸（K、R、H），78个酸性氨基酸（D、E），275个非极性疏水性氨基酸（G、A、V、L、I、F、P），170个极性氨基酸（W、S、Y、C、M、N、Q、T）。获得的NTPase编码基因及推导的氨基酸序列见图2。