一株生防芽孢杆菌的分离与鉴定
公司）、霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（北京柏莱斯特科技发展有限公司）、核酸蛋白检测仪（北京五洲东方科技发展有限公司）以及梯R仪（上海拜力生物科技有限公司）。
从国农业学烟台研究院校菜地采集土样阴干研磨称取0 g放入00 L无菌水50 L三角瓶摇动3～5 80 ℃水浴加热0 [6]。
挑取单菌落、镜检根据单菌落、表面结构、质地、光泽和颜色等特征挑取菌落形態差异明显单菌落采用划线分离方法纯化将已纯化菌株保存培养基斜面备用[7]。
对分离纯化到芽孢杆菌以供试病原真菌靶标采用平板对峙培养法[8]用皿琼胶平板直接测定。
以初筛结论基础平板心先接种病原菌两天四周接种种芽孢杆菌菌株两者相距5 3次重复分别以细菌和病原菌上纯培养对照8 ℃培养逐日观察菌落生长和细菌抑制作用筛选生长速快、抑制率高菌株。
参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]形态学指标将菌株分别接种牛肉膏蛋白胨培养基上倒置30 ℃恒温培养箱培养8 观察生防菌株培养基上菌落生长情况。
3 菌体形态观察。
挑取斜面培养8 生防芽孢杆菌菌落玻片上分别进行革兰氏染色、芽孢染色、及荚膜染色并显微镜下观察拮抗菌和形态。
将菌种接种LB液体培养基37 ℃温00 r夜培养 000 r离心收集菌体用 K r l试剂盒提取细菌基因组。
使用细菌6 r通引物7和 9R对提取基因组进行R扩增[0]。
R产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。
3 序列分析和系统发育树构建。
根据6rR测序结登陆B（进行序列相似性比对从获得相似性较高型菌株序列作参比对象用G80生物软件进行多序列比对并构建系统发育树。
结与分析 拮抗芽孢杆菌分离筛选试验共分离纯化芽孢杆菌33株平板对峙试验筛选出对病原菌具有拮抗作用菌株6株其菌株BQ对立枯丝核菌、玉蜀黍离蠕孢、腐皮壳霉、交链孢霉具有良拮抗作用确定优菌株（如图所示）。
培养特征观察结。
BQ培养基平板上菌落圆形或近圆形直径5 乳白色质地软、无色素、稍有光泽表面有褶皱蜡质边缘不整齐（如图所示）。
菌体形态观察结。
BQ菌体呈短杆状电子显微镜下（0～） μ×（30～0） μ培养8 产芽孢芽孢圆形或柱形生或近生0～5 μ孢囊无明显膨。
革兰氏阳性无荚膜（如图3所示）。
基因组提取及6 r R扩增利用 K r l试剂盒提取细菌基因组R扩增进行琼脂糖凝胶电泳检测（如图所示）获得了约 500 b条带。
3 6 r序列分析比对结以BQ基因组模板进行R扩增得到特异6r片段长 3 b（如图5所示）将BQ菌株6r测序结B进行Bl比对结表明BQ菌株与Bll r 3序列相似性达到99%通G5 0 软件构建系统进化树 结显示菌株BQ都与Bll r亲缘关系近。
3 结论试验对BQ菌株进行了分子鉴定及其生物学特性研究。
通6 r序列分析对BQ进行分子鉴定结表明BQ蜡样芽孢杆菌（Bll r）。
BQ培养基平板上菌落圆形或近圆形乳白色质地软、无色素、稍有光泽表面有褶皱蜡质边缘不整齐；斜面上划线培养呈直线生长；液体培养基生长液体混浊具有菌膜。
参考献[]吴金平宋志红向发云等拮抗细菌植物病害生物防治抗病机理[]湖北农业科学009（9）8688[] G kkr Zg l Blgl rl lr lrr（Lb） Br b Bl l l []r r007（）0007[3]周德慶微生物学实验手册[]上海上海科学技术出版社986[]马成涛胡青杨德奎土壤有益微生物防治植物病害研究进展[]山东科学007（6）666[5]张俊华微生物代谢产物作用植物研究探讨[]生命科学研究007（）7[6]邱德我国生物农药现状分析与发展趋势[]植物保护007（5）73[7]罗兰袁忠林陈茎麦全蚀病菌拮抗细菌筛选及鉴定[]青岛农业学学报006（3）0507[8]许光辉郑洪元土壤微生物分析方法手册「]北京农业出版社986[9]江木兰赵瑞胡加油菜生生防菌B油菜体定殖与对油菜菌核病防治作用[]植物病理学报007（3）0[0]东秀珠蔡妙英常见细菌系统鉴定手册「]北京科学出版社00