防风中色原酮类化合物的抗氧化活性研究
作者：李丽，桂语歌，时东方，刘春明。
【摘要】 目的采用超声提取法进行提取，考察了不同提取时间，不同提取温度及不同提取溶剂对防风中色原酮类化合物提取率的影响。方法采用Folin—Ciocalteu方法测定防风不同提取物总酚含量，采用DPPH抗氧化活性体外评价体系对防风不同提取物的抗氧化活性进行了系统研究。结果超声提取90 min样品总酚含量最高，而超声120 min乙醇提取物表现出强抗氧化活性。结论防风不同提取物表现出不同的抗氧化活性，但其抗氧化活性与总酚含量没有必然联系。
【关键词】 防风； 色原酮类化合物； 总多酚； 抗氧化活性； 二苯代苦味肼基自由基。
Abstract：ObjectiveTo study the antioxidant activity respectively with different ultrasound—assisted extraction, such as different time,temperature and solvent.MethodsFolin—Cilcaileu method was developed for evaluation of the total phenolic contents(TPCs) of different extracts.The free radical 2,2—diphenyl—1—picrylhydrazyl(DPPH) assay was then used to measure the antioxidant activity of different extracts.ResultsThe TPCs of 80% ethanol extract at 90 min showed the highest TPCs,however,the 80% ethanol extract at 120 min exhibited strong antioxidant activity in DPPH assay.ConclusionThe antioxidant activity in different samples didn‘t show any good correlation with total phenolic contents.
Key words： Saposhnikovia divaricata； Chromones； The total phenolic； Antioxidant activity； DPPH 防风为伞形科多年生草本植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk 的干燥根。药理研究表明，防风具有解热镇痛、镇静、抗炎、抗菌、抗过敏等多方面的药理作用［1，2］。防风中主要含有色原酮类、香豆素类以及多糖类等多种化学成分，而主要有效成分为色原酮化合物 ［3～9］ 。本文以防风中的色原酮化合物为研究对象，采用超声提取法进行提取，考察了不同提取时间，不同提取温度以及不同提取溶剂对防风中色原酮化合物提取率的影响。采用Folin—Ciocalteu方法测定防风不同提取物的总酚含量。采用DPPH 抗氧化活性体外评价体系对防风不同提取物的抗氧化活性进行了系统研究。
1 器材。
1.1 样品和试剂防风Saposhnikovia divaricata( Turcz. ) Schischk药材购于北京同仁堂长春药店；所用试剂均为分析纯试剂，购于北京北化精细化学品有限责任公司。没食子酸，Folin—Ciocalteu试剂， 2,2—diphenyl—1—picrylhydrazyl (DPPH˙)购自 Sigma Chemical Co.公司 (St. Louis, Mo)。
1.2 仪器旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；SHB—Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；BS—124S电子天平（Sartorius AG,Sartorius）；加样枪（Germany）；HS—Z11—Ⅱ电热蒸馏水器（上海跃进医疗器械厂）；紫外—可见分光光度仪（DU 800, Beckman Coulter, Inc. USA）。
2 方法。
2.1 样品制备精密称取2 g防风样品，采用80%乙醇为提取溶剂，分别超声提取30，60，90，120，150 min，提取液过滤，水浴温度40℃减压回收乙醇至干，用3 ml 80%乙醇定容得样品提取液。 精密称取2 g防风样品，采用80%乙醇为提取溶剂超声提取0.5 h，提取2次，提取温度分别为30，40，50，60，70，80℃，将提取液过滤，水浴温度40℃减压回收乙醇至干，用3 ml 80%乙醇定容得样品提取液。 精密称取2 g防风样品，以80%乙醇，正丁醇和醋酸乙酯为提取溶剂，30℃超声提取0.5 h，提取2次，将提取液过滤，水浴温度40℃减压回收乙醇至干，用3 ml 80%醋醇定容得样品提取液。
2.2 样品总多酚含量测定样品总酚含量的测定采用国际上通用的Folin— Ciocalteu 方法［10］, 样品总酚含量结果表示为每克提取物中含有相当没食子酸的毫克数。吸取0.2 ml一定浓度的没食子酸标准品溶液，加入1 ml 0.5 mol/L的Folin—Ciocalteu试剂, 再加入0.8 ml 7.5%的碳酸钠溶液充分混合，室温下放置30 min，然后在765 nm下测吸光度值(紫外—可见分光光度仪：DU 800，Beckman Coulter, Inc. USA)，所有试验重复2次，得没食子酸标准曲线方程为：Y=9.562 3X—0.133 2（R2=0.999 9），没食子酸溶液(质量浓度范围为0.02～0.2 mg/ml)。之后吸取0.2 ml一定浓度的不同提取方式的样品溶液，使样品溶液的吸光值落在标准曲线上，加入1 ml 0.5 mol/L的Folin—Ciocalteu试剂, 再加入0.8 ml 7.5%的碳酸钠溶液充分混合，室温下放置30 min， 然后在765 nm下测吸光度值，得样品溶液的吸光度值，代入标准曲线方程，得到样品的总酚含量。
2.3 DPPH方法测定样品的抗氧化活性准确称取［DPPH ·］，配置浓度为0.040 76 mg/ml的［DPPH ·］乙醇溶液，得到［DPPH ·］标准曲线方程为：Y=18.032X—0.001 6，R2=0.999 3。自由基残留率的测定及计算方法参照文献［11，12］。 在实验中以乙醇为溶剂配制不同浓度的样品和标准品溶液，分别精密吸取0.1 ml 样品或标准品溶液, 加入3.9 ml 质量浓度为2.5 mg/100 ml［DPPH ·］溶液(现用现配)，以乙醇替代样液为空白。将混合溶液摇匀，用比色皿，在515 nm 波长处，测定其在不同时间的吸光度值。根据标准曲线可以换算成［DPPH ·］ 的质量浓度, 从而计算出［DPPH ·］残留率。根据［DPPH ·］残留率和相应的样品添加量，可以绘制样品清除［DPPH ·］自由基的曲线。根据［DPPH ·］的质量浓度与吸光度的关系曲线，可以将添加自由基清除剂后测得的吸光度换算为［DPPH ·］的质量浓度，从而计算出添加自由基清除剂后的［DPPH ·］残留率［11，12］，其计算公式如下。 ［DPPH ·］ REM = ［ DPPH ·］T / ［ DPPH ·］T=0 ×100 % 其中［DPPH ·］ T 为自由基清除过程中某一时刻［DPPH ·］的质量浓度，［DPPH ·］ T=0为［DPPH ·］的原始质量浓度。根据抗氧化剂添加量与［DPPH ·］残留率，制作二者的关系曲线，通过线性回归分析可以得到回归方程，根据回归方程式可以计算出［DPPH ·］残留率为50 %时的抗氧化剂量即半抑制量［11，12］。 根据不同浓度样品或标准品清除［DPPH ·］ 自由基的曲线，计算得到［DPPH ·］的原始质量浓度减少至50 %(稳定态) 时样品的添加量( EC50)， EC50越小其清除自由基能力越强。此外我们还计算了自由基清除能力AE(Antiradical efficiency)值, AE = 1/ EC50 。根据AE 的大小判断抗氧化剂清除自由基的能力的大小，AE越大其清除自由基能力越强。