桃核承气汤对蓄血证大鼠血管MMP2,TIMP2基因表达的影响

【摘要】 ［目的］观察桃核承气汤对蓄血证大鼠血管基质金属蛋白酶2(Matrix MetalloprotEinase2，MMP2)及金属蛋白酶2组织抑制剂( Tissue Inhibitor of MetalloprotEInase2，TIMP2)基因表达的 影响 ，探讨此方的作用机制。［ 方法 ］半定量RT－PCR检测各组大鼠颈总动脉匀浆中MMP2、TIMP2基因的表达，进行 分析 。［结果］与模型组相比,药物组减少了MMP2基因的表达，增加了TIMP2的表达(P0.01)。［结论］桃核承气汤能改变蓄血证大鼠动脉壁MMP2、TIMP2基因的表达，这可能是其主要作用机制之一。

【关键词】 桃核承气汤；蓄血证；基质金属蛋白酶2；金属蛋白酶2组织抑制剂。

毕业论文。

Abstract： ［Objective］To investigate the effects of Taohechengqitang(THCQT) on the gene expression of Matrix Metalloproteinase2(MMP2) and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase2(TIMP2)in artery vessel of Xuxuezheng rats.［Methods］Half quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR) was used to detect MMP2 and TIMP2 gene expression in artery vessel. The y were analyzed.［Results］While compared with model group，MMP2 gene expression levels in the THCQT group were lower,and TIMP2 was higher (P0.01).［Conclusion］THCQT can change the gene expression of MMP2 and TIMP2 in artery vessels of Xuxuezheng rats, which may account for the effects. 论文网。

Key words: Taohechengqitang;Xuxuezheng;MMP2;TIMP2 　　桃核承气汤是《伤寒论》中 治疗 蓄血证的主方之一，具有活血祛瘀、泻热攻下的功效，在临床上，已经证实可以有效地治疗各科疾病；而既往实验 研究 也已表明其有改善微循环［1］，抗肿瘤［2］等作用。但蓄血证及桃核承气汤与MMP2、TIMP2是否具有相关性，缺乏报道。本文探讨桃核承气汤对蓄血证大鼠血管MMP2、TIMP2基因表达的影响。

1 材料和方法 代写论文。

1.1 材料 健康雄性SD大鼠30只，体重300～350g（由浙江中医药大学实验动物中心提供）。造模材料：大肠杆菌内毒素（E.Cole O55:B5），美国Sigma公司产品，用生理盐水配成20μg/ml的溶液。药液制备：桃仁∶大黄∶桂枝∶芒硝∶甘草=2∶2∶1∶1∶1（中药饮片由浙江中医药大学门诊部提供），适量水煎，头煎20min，二煎30min，分别滤取药液，合并两次药液，在60℃恒温条件下浓缩成每ml含生药1g的药液备用。主要试剂：Trizol reagent,美国Invitrogen 公司产品；反转录试剂盒(Reverse Transcription System)，美国Promega 公司；Taq DNA 聚合酶，Takara公司；βactin 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器：台式高速冷冻离心机，德国Heraeus 公司；PCR仪，TECHNE；紫外分析仪，ZF－1型，上海嘉鹏 科技 公司；电泳仪，DYY－8B型稳压稳流电泳仪；核酸蛋白仪，Amersham Biosciences。 毕业论文。

1.2 方法 将30只大鼠按随机数字表法分成空白对照组(control)、模型组(model)、药物组(THCQT)3组，每组10只。造模方法 参考 文献 ［11］：模型组，间隔24h，两次尾静脉注入大肠杆菌内毒素（剂量分别为50μg/kg）；药物组，于第1次注入内毒素前2h左右，胃管内注入药物（10ml/kg），12h后再给药1次，在第2次注入内毒素前2h左右再给药1次；对照组，两次尾静脉注入生理盐水，剂量方法同上。 　　RNA的提取及逆转录：第2次注入内毒素（或生理盐水）后2h，大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉(4.5ｍｇ/100ｇ)，取出各组大鼠颈总动脉0.5g，分别以Trizol试剂提取总RNA。提取后以紫外光分光光度计测定其纯度并定量，在1%的甲醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性。逆转录以AMV逆转录酶提供的体系为标准，在PCR管中配制逆转录反应液，轻轻混匀，室温放置10min后移入恒温槽中，42℃保温1h进行逆转录反应。反应结束后在冰水中冷却2min。所得到的反应液用于PCR反应。 　　PCR检测MMP2、TIMP2的基因表达量：根据genebank上提供的MMP2,TIMP2基因的序列设计引物，引物序列见表1。以Actine基因作为内参，进行PCR反应。取上述的逆转录产物2μL作为PCR反应的模板，反应体系为50μL，于0.2 mL PCR薄壁管中依次加入反转产物2μL,dNTP8μL，PCR10×Reaction Buffer 5μL，Taq DNA Polymerase 0.5μL，上下引物2μL，MgCl2 2μL，DEPC水30.5μL。扩增条件：94℃预变性5min后，94℃变性30s、48℃退火40s、72℃延伸40s，反应30个循环，最后一轮72℃延伸5min，同时设置PCR扩增仪的热盖温度为105℃。扩增产物取5μL在1%琼脂糖(含EB 0.5 ng/mL)上电泳，另取3u1 Marker作为DNA片段大小的对照。紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，每一个基因的表达量用Actine内参进行标准化，结果为基因表达量对Actine内参的比值。 代写论文 　　统计学方法：数据以均数±标准差(x±s)表示，统计学处理 应用 SPSS11.5软件，采用方差分析和q检验，P0.05为差异有显著性。 论文代写。

2 结果 　　所提的动脉壁组织总RNA 经核酸蛋白仪纯度鉴定为良好，电泳鉴定证实RNA 完整性较好。定量分析显示：与对照组相比，模型组与药物组MMP2基因的表达均增加( 均为P0.01)；与模型组相比，药物组能减少MMP2基因的表达(P0.01)；与对照组相比，模型组与药物组TIMP2基因的表达显著减少( 均为P0.01)；与模型组相比，药物组增加了TIMP2 基因的表达(P0.01)，见图1，表1、2。

表1 RTPCR引物序列（略） 毕业论文。

表2 各组动物动脉壁中MMP2与TIMP2相对基因表达量比较（略）。

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d P0.01 vs control；f P0.01 vs model。

图1 MMP2与TIMP2的基因表达电泳（略） 　　M：100bp标准分子量Marker；1：MMP对照组，2：MMP模型组，3：MMP用药组；1’：TIMP对照组，2’：TIMP模型组，3’：TIMP用药组。